劉曉峰 陳玲 廖然 殷錫虎 汪光枝

(九江市第一人民醫(yī)院 南昌大學(xué)附屬九江醫(yī)院心血管內(nèi)科，江西 九江 332000)

冠心病的嚴(yán)重程度由斑塊的穩(wěn)定性決定，炎癥免疫反應(yīng)在斑塊穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用〔1〕。研究表明免疫調(diào)節(jié)失衡在不穩(wěn)定斑塊的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，其中T淋巴細(xì)胞參與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)抗原的應(yīng)答反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊的發(fā)生和進(jìn)展〔2〕。最新研究發(fā)現(xiàn)自身免疫在冠心病中可能發(fā)揮著重要作用〔3〕。樹(shù)突細(xì)胞(DC)是目前發(fā)現(xiàn)的機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞,極少量的DC即可強(qiáng)烈激活T淋巴細(xì)胞啟動(dòng)特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)〔4〕。T淋巴細(xì)胞的激活可能在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化起始和斑塊的穩(wěn)定性中起重要作用〔5〕。免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄子(ILT)3，屬于抑制性受體，可表達(dá)于DC和T淋巴細(xì)胞表面，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)在急性冠脈綜合征(ACS)患者的破裂斑塊中和外周循環(huán)血均可檢測(cè)到異常增殖的T細(xì)胞〔7〕。本研究首先檢測(cè)冠心病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中ILT3的表達(dá)，再通過(guò)在體外建立混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MIR)，進(jìn)一步探討ILT3參與冠心病發(fā)生發(fā)展的免疫機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2014年1月至2017年12月九江市第一人民心血管內(nèi)科心內(nèi)科住院冠心病患者100例，所有患者依據(jù)病史、心絞痛癥狀、心電圖、心肌酶學(xué)檢查結(jié)果分為：穩(wěn)定性心絞痛(SAP)組45例，男25例，女20例，年齡(61±10)歲;ACS組55例，男43例，女12例，年齡(56±8)歲。所有患者經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并急慢性感染、膠原結(jié)締組織病、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、周?chē)懿?、惡性腫瘤、進(jìn)展期肝腎病者；服用免疫抑制劑、非甾體類(lèi)炎癥抑制劑等藥物。本研究獲得九江市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選者簽署知情同意書(shū)。兩組年齡及性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2研究方法

1.2.1PBMC的分離 采用Ficon密度梯度離心法：所有患者在入院24 h內(nèi)，在無(wú)菌條件下，空腹抽取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血10 ml用RPMI1640 1∶1培養(yǎng)稀釋到20 ml，用毛細(xì)滴管插到云霧層，全部吸取單個(gè)核細(xì)胞(避免吸出分層液)，置入另一離心管中，然后加入5倍以上體積的RPMI1640液，1 500 r/min×10 min，洗滌細(xì)胞兩次，獲得PBMC。

1.2.2外周血DC分離和體外培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下，用37℃無(wú)血清的RPMI1640液體培養(yǎng)基充分吹打上述分離得到的PBMC，使成均勻細(xì)胞懸液，用濃度為50 ng/ml的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和50 ng/ml的重組人白細(xì)胞介素(rhIL)-4,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5 d。第6天加入白細(xì)胞介素(IL)-1β(10 ng/ml),腫瘤壞死因子(TNF)-α(50 ng/ml)和Toll樣受體配體polyⅠ:C(20 μg/ml),均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。繼續(xù)培養(yǎng)2 d,第8天收獲懸浮細(xì)胞，顯微鏡下鑒定。

1.2.3應(yīng)用MACS 免疫磁珠陰性分選得CD4+T淋巴細(xì)胞 采用Ficon密度梯度離心法分離臍帶血獲得的PBMC，用RPMI1640 1∶1培養(yǎng)稀釋到10 ml，采用應(yīng)用MACS 免疫磁珠陰性分選，將分選獲得的CD4+T淋巴細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度在1×106/ml，備用。提取的CD4+T調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以流式細(xì)胞儀行純度檢測(cè)。

1.2.4細(xì)胞因子檢測(cè) 各組分離培養(yǎng)的DC和臍血分離的CD4+T細(xì)胞混合培養(yǎng)。4 d后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測(cè)干擾素(IFN)-γ、TNF-β和IL-10細(xì)胞因子水平,在酶標(biāo)儀上,于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度(D)值。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞的百分比，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樣品 上述分離純化的細(xì)胞用10%FBS RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml,取細(xì)胞懸液100 μl，分別加入6 μl CD4-PE、6 μl ILT3-FITC抗體，混合反應(yīng)后，操作同前，上流式細(xì)胞儀檢測(cè);然后獲取條件分別為CD4-PE、CDILT3-FITC陽(yáng)性。依次收集標(biāo)本，收集細(xì)胞數(shù)至少5 000個(gè)細(xì)胞，分析熒光強(qiáng)度，數(shù)據(jù)存盤(pán)，測(cè)試結(jié)束后在計(jì)算機(jī)上用CellQustPlot軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算獲得細(xì)胞百分?jǐn)?shù)表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1ILT3在兩組PBMC的表達(dá) SAP組PBMC的ILT3 陽(yáng)性率為〔(80.13±2.10)%〕，顯著高于ACS組〔(1.83±0.91)%，P<0.01〕。

2.2兩組CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞百分比比較 SAP組CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞數(shù)量百分比為〔(89.2±2.3)%〕，較ACS組〔(39.5±5.3)%〕明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3兩組細(xì)胞因子水平比較 ACS組IFN-γ和TNF-β水平比SAP組明顯升高，IL-10水平在SAP組比ACS組有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 兩組細(xì)胞因子水平比較

與SAP組比較：1)P<0.01

3 討 論

研究表明，炎癥免疫反應(yīng)參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展以致易損斑塊和血栓的形成〔8〕。其中T細(xì)胞參與的免疫激活在冠脈斑塊破裂中起主導(dǎo)作用〔9〕。急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)的發(fā)生中，冠狀動(dòng)脈易損斑塊的形成可能是T細(xì)胞介導(dǎo)的一種免疫失衡性疾病〔10〕。研究表明,在機(jī)體免疫耐受的產(chǎn)生和維持中起重要作用的CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞，通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)來(lái)抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的作用,發(fā)揮免疫耐受，減少炎癥免疫性疾病的發(fā)生〔11〕。盡管目前尚未將動(dòng)脈粥樣硬化歸類(lèi)于自身免疫性疾病。但有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞能夠增加斑塊的穩(wěn)定性〔12〕。研究已經(jīng)表明CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞能夠直接溶解內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞，而導(dǎo)致斑塊破裂〔13〕，與CD4+CD28-T細(xì)胞亞群作用相反,CD4+CD25+T是最近研究發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群之一，參與調(diào)節(jié)與冠狀動(dòng)脈斑塊的穩(wěn)定性〔2〕。ILT3可表達(dá)于DC表面，傳導(dǎo)抑制性信號(hào)，抑制殺傷性NK 細(xì)胞的活性，參與細(xì)胞抗原俘獲、抑制細(xì)胞炎癥免疫作用〔14〕。 有研究表明，高表達(dá)ILT3的DC細(xì)胞可抑制T淋巴細(xì)胞的增殖與活化〔15〕。ILT3可通過(guò)抑制DC的共刺激分子的表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞〔16〕。本研究結(jié)果顯示PBMC中ILT3表達(dá)的變化參與冠心病的發(fā)生發(fā)展中。

將抗原特異性CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞輸入小鼠觀察到其可抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展,說(shuō)明CD4+CD25+T淋巴具有負(fù)向調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)的作用〔17〕。急性心肌梗死患者CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞表達(dá)百分比與正常對(duì)照組相比會(huì)降低，這表明可能在冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊活動(dòng)或破裂過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔18〕。本研究推斷CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞對(duì)維持動(dòng)脈粥樣硬化患者斑塊的穩(wěn)定性發(fā)揮重要作用且與ILT3高表達(dá)相關(guān)。

抗原提呈細(xì)胞是啟動(dòng)免疫應(yīng)答的起始環(huán)節(jié)，DC是目前發(fā)現(xiàn)的機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞，最近發(fā)現(xiàn)在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中DC增多〔19〕。成熟的DC可分泌多種細(xì)胞因子，參與T淋巴細(xì)胞的增殖和免疫調(diào)節(jié)功能〔20〕。本研究提示高表達(dá)ILT3的DC釋放IL-10而穩(wěn)定斑塊。