吳雯雯 （南通科技職業(yè)學(xué)院，江蘇省南通市 226007）

薄荷是唇形科薄荷屬多年生宿根性草本植物，全草可入藥，被廣泛用于中醫(yī)藥領(lǐng)域，也是世界著名的香料植物，具有較高的藥用、食用和工業(yè)價(jià)值。全世界薄荷屬植物有30種、140多個(gè)變種，分布于美國(guó)、印度、日本等[1]。薄荷在我國(guó)各地也有廣泛栽培，主要栽培于江蘇、安徽、河南和江西等省，目前，我國(guó)的薄荷屬植物有12種，其中野生種有6種[2]。

薄荷喜生長(zhǎng)在溪邊、河灘等潮濕地帶，因長(zhǎng)時(shí)間栽培，種間雜交情況普遍，故對(duì)其進(jìn)行屬內(nèi)種間的鑒定較為困難[1]。傳統(tǒng)的分類方法有形態(tài)學(xué)分類法和化學(xué)成分分析法，但這兩種方法均有一定的局限性，其中，形態(tài)學(xué)分類法只能初步鑒定薄荷屬不同植物種類，且在實(shí)際操作中易受人為觀測(cè)誤差的影響；化學(xué)成分分析法易受外界環(huán)境因子的影響[3]。近年來(lái)，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，DNA水平的標(biāo)記因具有不受基因表達(dá)和環(huán)境影響的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析[4]。例如，謝琳等[5]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)引種到海南的14個(gè)薄荷種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并將其分為六大類；陳小華[6]利用AFLP分子標(biāo)記將收集到的28個(gè)薄荷品種分為七大類。同時(shí)，隨著分子鑒定技術(shù)的發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)隨之產(chǎn)生，DNA條形碼鑒定法是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA序列來(lái)進(jìn)行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)，具有鑒定速度快、可重復(fù)性強(qiáng)、不受內(nèi)外因子影響等優(yōu)點(diǎn)，是傳統(tǒng)鑒別方法的有效補(bǔ)充[7]。例如，陳士林等[8]推薦將ITS2作為藥用植物通用條形碼，并建立了一套鑒別技術(shù)體系。目前，DNA條形碼鑒定法在石斛、兩面針、矮地茶等藥材的識(shí)別和遺傳關(guān)系分析上已取得了一定的進(jìn)展[9-11]，但利用該技術(shù)對(duì)我國(guó)薄荷主栽品種進(jìn)行遺傳分析的報(bào)道較少，僅有龐曉慧等[12]利用ITS2序列對(duì)薄荷及其相關(guān)種進(jìn)行了鑒定分析。為此，本研究基于ITS序列，對(duì)收集到的11個(gè)薄荷種質(zhì)進(jìn)行了遺傳關(guān)系分析，以期為發(fā)展DNA條形碼技術(shù)、分析薄荷遺傳關(guān)系和開(kāi)發(fā)利用薄荷優(yōu)良品種提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究采用來(lái)自9個(gè)物種的11個(gè)樣本，分別為圓葉薄荷[Mentha rotundifdia(Linn.) huds]、胡椒薄荷-01（Mentha piperita-01）、胡椒薄荷-02（Mentha piperita-02）、美國(guó)薄荷（Monarda didymaL.）、香水薄荷（Mentha arvensis）、蘋果薄荷（Mentha suaveolens）、留蘭香（Mentha spicataLinn.）、歐薄荷[Mentha longifolia(Linn.)huds]、亞洲薄荷-01（Mentha asiatica-01）、亞洲薄荷-02（Mentha asiatica Boriss-02）、檸檬薄荷（Mentha citrata），編號(hào)依次為M1-M11。上述11個(gè)薄荷種質(zhì)資源引種地點(diǎn)見(jiàn)表1，所有材料經(jīng)鑒定后栽種于南通科技職業(yè)學(xué)院園藝苗圃基地內(nèi)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 儀器和試劑

主要儀器：PCR儀（ABI verity），離心機(jī)（Eppendorf 5415D），DYY-6C電泳（北京六一儀器廠），dycp-31dn電泳槽（北京六一儀器廠），Bioses SC 760凝膠電泳圖象采集儀（上海山富科學(xué)儀器有限公司），37 ℃恒溫培養(yǎng)箱（VWR公司），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）。

表1 11個(gè)薄荷種質(zhì)資源信息統(tǒng)計(jì)

主要試劑：基因組DNA提取試劑盒（南通麥杰生物技術(shù)有限公司），Taq DNA聚合酶/ pfu DNA聚合酶（南通麥杰生物技術(shù)有限公司），dNTPs（南通麥杰生物技術(shù)有限公司），DL2000 ladder（Takara公司）。

1.2.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

稱取薄荷葉片8 mg左右，置于研缽中，采用液氮速凍后，研碎葉片，然后采用植物DNA提取試劑盒提取薄荷基因組DNA。本研究根據(jù)植物保守區(qū)域設(shè)計(jì)擴(kuò)增ITS序列所用的通用引物，正向引物為ITS-F:CCGTAGGTGAACCTGCGG，反向引物為ITS-R:GACGCTTCTCCAGACTA。PCR反應(yīng)總體積為50μL。

反應(yīng)體系：10M正反向引物各1μL，taq酶（5U/）1μL，10mM dNTP 1μL，基因組DNA 2μL，10×buffer 5μL，加雙蒸水至50μL。

擴(kuò)增程序：預(yù)變性95 ℃，5 min；95 ℃，30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，2 min；擴(kuò)增40循環(huán)，周末延伸72 ℃，7 min；4 ℃保溫；將PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序。

引物合成和測(cè)序由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用SeqMan軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)，獲得ITS全序列。利用軟件MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)5.0計(jì)算物種種內(nèi)種間Kimura 2-parameter(K2P)遺傳距離。應(yīng)用最近距離法(Nearest Distance)、構(gòu)建NJ(鄰接)系統(tǒng)聚類樹(shù)方法對(duì)薄荷進(jìn)行遺傳關(guān)系鑒定分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列

應(yīng)用MEGA 5.0軟件分析11條ITS序列，序列長(zhǎng)度在576～709 bp，堿基A占?jí)A基總數(shù)的18.75%，堿基T占?jí)A基總數(shù)的30.84%，堿基C占?jí)A基總數(shù)的16.49%，堿基G占?jí)A基總數(shù)的33.90%，（G+C）的含量變幅為60.86%～67.47%，平均（G+C）含量為64.75%。所有序列經(jīng)過(guò)校對(duì)后提交Genbank，獲得的登錄號(hào)見(jiàn)表1。

2.2 遺傳距離分析

由表2可知，應(yīng)用最近距離法分析薄荷各品種間遺傳距離，其遺傳距離為0.001～1.365，平均值為0.456 6。其中，美國(guó)薄荷和檸檬薄荷間遺傳距離最大，為1.365，說(shuō)明這兩個(gè)品種間的差異較大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；圓葉薄荷、歐薄荷、胡椒薄荷-01、胡椒薄荷-02間遺傳距離均小于0.007，表明這4個(gè)品種的親緣關(guān)系較近，尤其是圓葉薄荷和歐薄荷間遺傳距離很近，幾乎為0，說(shuō)明兩者間的親緣關(guān)系最近；蘋果薄荷與檸檬薄荷間遺傳距離為0.163，而這兩個(gè)品種與其他品種間遺傳距離均在1.0以上，說(shuō)明這兩個(gè)品種的遺傳背景極其相似，親緣性極為接近。

表2 11個(gè)薄荷種質(zhì)資源K2P遺傳距離

2.3 基于ITS的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

基于ITS序列，構(gòu)建NJ(鄰接)系統(tǒng)聚類樹(shù)，見(jiàn)圖1。NJ樹(shù)顯示，11個(gè)薄荷種質(zhì)資源可分為三大類。第一大類包括美國(guó)薄荷、香水薄荷、亞洲薄荷（亞洲薄荷-01和亞洲薄荷-02）和留蘭香；第二大類包括胡椒薄荷（胡椒薄荷-01和胡椒薄荷-02）、圓葉薄荷和歐薄荷；第三大類包括蘋果薄荷和檸檬薄荷。從聚類分析結(jié)果來(lái)看，亞洲薄荷群體聚成一類，胡椒薄荷群體聚成一類，說(shuō)明這些群體的遺傳關(guān)系較近，且種內(nèi)薄荷種質(zhì)資源基本能聚合在一起。

3 結(jié)果與討論

本研究利用ITS序列分析方法，對(duì)收集的11個(gè)薄荷種質(zhì)構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示，11個(gè)薄荷種質(zhì)資源可分為三大類；從聚類分析結(jié)果來(lái)看，兩個(gè)胡椒薄荷品種聚為一類，說(shuō)明這兩個(gè)胡椒薄荷品種的遺傳關(guān)系較近；本研究所采集的圓葉薄荷與留蘭香不歸在一類，這與預(yù)期有所差異，但這也顯示了我國(guó)留蘭香群體有較大的遺傳多樣性，這為今后留蘭香新品種的培育提供了較大的可選擇空間；香水薄荷和美國(guó)薄荷歸為一類，這和謝琳等[5]的研究結(jié)果一致。綜上，本研究選用ITS序列對(duì)11份薄荷種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，基于ITS序列構(gòu)建的NJ(鄰接)系統(tǒng)聚類樹(shù)分支明顯，可有效分析薄荷屬植物的遺傳關(guān)系。

薄荷屬植物在自然環(huán)境下生長(zhǎng)容易發(fā)生變異，這有利于薄荷品種改良，但也造成了其遺傳背景的關(guān)系[13]。基于序列分析的DNA條形碼技術(shù)是目前影響較大、應(yīng)用較廣泛的DNA鑒定技術(shù)，能克服傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法和常用DNA分子標(biāo)記技術(shù)的缺陷，具有可重復(fù)性良好、方法通用性強(qiáng)、可構(gòu)建統(tǒng)一數(shù)據(jù)庫(kù)和易于推廣等優(yōu)勢(shì)。