閆永蘭

（西安科技大學，陜西 西安 710000）

羊肚菌（Morchella） 是一種珍稀食藥兼用菌種，因其子實體外形酷似羊肚而得名[1]。我國羊肚菌種植廣泛，在我國20 多個省市都有分布。羊肚菌的子實體的顏色有黑、黃和漸變紅3 種，整個羊肚菌屬有30 多個種，我國栽培最為廣泛的是梯棱羊肚菌，占羊肚菌總栽培量的95%左右。

羊肚菌具有獨特的香味，是一種不可多得的珍饈美味；同時，羊肚菌富含氨基酸蛋白質，及硒、鐵等多種礦物質，是一種重要的健康營養(yǎng)食品。從羊肚菌中提取的多糖，具有抗氧化、促進人體代謝、調節(jié)免疫力、抗疲勞、抗衰老等多種功效。羊肚菌多糖提取物已經(jīng)成為了一個熱門研究領域。

羊肚菌中多糖含量高、易于提取，主要的提取方法有水提醇沉法、酸堿浸提法、超聲波法、酶液浸提法等，其中酶液浸提法因其得率高、對多糖的天然結構破壞較少等優(yōu)勢，能夠保持多糖的生物活性，成為了羊肚菌等菌類多糖提取的重要方法[2]。通過以酶液浸提法方法提取羊肚菌多糖，并對其抗氧化和抗衰老功效進行研究。以D-半乳糖衰老模型和谷胱甘肽過氧化物酶模型相關數(shù)據(jù)的測定，研究酶提羊肚菌子實體多糖混合溶液的抗衰老、抗氧化活性，為羊肚菌多糖抗衰老產(chǎn)品的研發(fā)提供科學依據(jù)。

1 研究材料和方法

1.1 試驗材料

羊肚菌子實體用研磨機粉碎后，過80 目篩，取50 g 放入2 000 mL 蝸牛酶溶液中，蝸牛酶溶液濃度為（0.04±0.01） %，放入恒溫箱［恒溫箱溫度（35±2）℃］浸泡2 h，取出上清液，重復3 次后進行加熱濃縮，濃縮液中加入95%的乙醇溶液，放入恒溫箱沉淀，溫度為（4±0.5） ℃，靜置24 h，上離心機3 000 r·min-1連續(xù)運轉10 min 后分離懸浮液中的固體顆粒，將獲取的固體顆粒沉淀物在烘箱，溫度為（55±2） ℃，烘干即可得到羊肚菌酶提子實體多糖，作為本次試驗的主要材料[3]。

1.2 試驗試劑

主要試劑如表1 所示，其它試劑純級均為適用于工業(yè)分析及化學試驗的分析純，符合本次試驗要求。

表1 試驗主要試劑Tab.1 Test main reagent

1.3 試驗儀器

主要試驗儀器如表2 所示。

表2 試驗主要儀器Tab.2 Test the main instrument

1.4 抗衰老活性動物試驗

動物研究對象為無特定病的小白鼠60 只，濟南市金豐實驗動物有限公司［生產(chǎn)實驗動物資質許可證號：SCXK（魯）］，均為近交純和系，12 個月齡，體重（30±5） g。正常飼料室溫條件喂養(yǎng)，自由進食飲用純凈水，飼養(yǎng)1 周后按雌雄各半隨機分成正常組、高劑量對照組和低劑量對照組共3 組，每組20 只。

正常組：灌胃0.2 mL 生理鹽水，24 h 后，腹腔注射生理鹽水0.2 mL；

低劑量組：灌胃酶提羊肚菌子實體多糖溶液200 mg·kg-1，24 h 后，腹腔注射D-半乳糖；

高劑量組：灌胃羊肚菌酶提子實體多糖溶液400 mg·kg-1，24 h 后，腹腔注射D-半乳糖；

連續(xù)給藥21 d，最后1 次給藥后將小鼠斷頭處死，采血在離心機12 000 r·min-1，10 min 分離血清，并馬上摘取胸腺、脾臟、肝臟、腎臟和腦組織等臟器合并稱重，用等滲生理鹽水制備10%組織勻漿備用。通過測定小白鼠肝、腎組織的谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA） 等含量來分析酶提羊肚菌子實體多糖的總體抗氧化能力和水平。

1.5 試驗方法

摘取小白鼠的胸腺、脾臟稱重，計算胸腺/脾臟指數(shù)（A，%）[4]公式為：

式中：T為胸腺重量（g）；S為脾臟重量（g）；G為體重（g）。

抗氧化采用總抗氧化能力（T-AOC） 試劑盒檢測；SOD 活性指標按“SOD=（1-對照吸光值/樣品吸光值）/0.5×稀釋倍數(shù)”的模型計算[5]，使用超氧化物岐化酶(SOD) 試劑盒檢測；GSH-Px 活性檢測采用細胞谷胱甘肽過氧化物酶活性檢測試劑盒；MDA 檢測采用丙二醛(MDA) 試劑盒，使用TBA 法檢測，以上活性指標的測定均按各試劑盒說明書規(guī)范操作。

使用全自動生化分析儀器測定血清中谷丙轉氨酶（ALT） 和肌酐（CRE） 等水平，用于血清學指標的分析。

2 試驗結果與分析

酶提羊肚菌子實體多糖對小白鼠胸腺及脾臟指數(shù)、抗氧化抗衰老能力和血清指標的影響試驗結果如下。

2.1 對小白鼠胸腺及脾臟指數(shù)的影響

酶提羊肚菌子實體多糖對小鼠胸腺及脾臟指數(shù)的影響見表3。

表3 酶提羊肚菌子實體多糖對小白鼠胸腺及脾臟指數(shù)的影響Tab.3 Effects of polysaccharides extracted from Morchella spp.fruiting body on thymus and spleen indexes of mice

由表3 可知，小白鼠的胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)相比變化明顯，低劑量組與正常組相比，胸腺指數(shù)提升了16.07%，而高劑量組比低劑量組又提升了14.29%。這說明胸腺指數(shù)與酶提羊肚菌子實體多糖的劑量成正比，提高劑量可以有效提升胸腺指數(shù)。但酶提羊肚菌子實體多糖的劑量對脾臟指數(shù)的影響較小，只能微弱提升脾臟指數(shù)，對脾臟指數(shù)的影響十分有限。

2.2 SOD、GSH-Px、MDA 抗氧化指標和總抗氧化能力的影響

羊肚菌酶提子實體多糖對小白鼠T-AOC、SOD、GSH-Px、MDA 指標的影響如表4 所示。

超氧化物歧化酶（SOD） 是一種抗氧化酶，可以對機體的新陳代謝進行干預，增強機體的抗氧化能力，清除生物體內的有害物質，從而延緩衰老。在臨床上SOD 也是檢驗人體是否健康的重要醫(yī)學指標。通過測定小白鼠臟器組織中的超氧化物歧化酶（SOD） 含量，可以了解小白鼠肝臟清除氧自由基的能力。試驗結果顯示，低劑量組與正常組相比，SOD 活性指標變化明顯，提升了44.85%，而高劑量組比低劑量組又提升了23.83%，達到了（167.74±12.16） U·mg-1prot。這說明給小白鼠灌注羊肚菌酶提子實體多糖溶液后，SOD 活性出現(xiàn)了不同程度的提升。

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px） 能清除細胞外的過氧化氫，是一種重要的過氧化物分解酶，它能夠將有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，也是臨床抗過氧化能力的重要指標。本試驗結果顯示，低劑量組與正常組相比，GSH-Px 活性指標變化明顯，提升了33.87%，而高劑量組比低劑量組又提升了17.94%，達到了（112.02±5.75） U·mg-1prot。試驗結果說明酶提羊肚菌子實體多糖具有保護小白鼠肝臟的功能。

丙二醛（MDA） 是過氧化反應的殘留物，有毒。由于MDA 是一種有氧自由基代謝產(chǎn)物，因此常用于檢測機體的過氧化程度，是臨床上用于反映機體的受損傷和衰老程度的重要指標。試驗結果顯示，低劑量組與正常組相比，MDA 活性指標提升了30.49%，但加大劑量后，MDA 指標反而出現(xiàn)了下降，高劑量組比低劑量組下降了41.65%，只有（4.02±0.27） μmol·L-1。試驗結果表明，低劑量的多糖會增加MDA 含量，分析原因可能是低劑量的多糖會影響小白鼠體內自由基生成與清除的平衡狀態(tài)，引起機體的應激反應，導致MDA 升高。但高劑量組的試驗結果表明，MDA 的含量有明顯下降，說明酶提羊肚菌子實體多糖能夠提高小白鼠的抗氧化能力，減緩機體組織的損傷衰老速率。

抗氧化能力與人體的健康存在密切的關系，總抗氧化能力(T-AOC) 是抗氧化自由基能力的總體評價，T-AOC 能夠有效抑制自由基的氧化反應。試驗結果顯示，低劑量組與正常組相比，T-AOC 指標提升了55.74%，而高劑量組比低劑量組又提升了56.84%，達到了（1.49±0.19） U·g-1。這說明給小白鼠灌注酶提羊肚菌子實體多糖溶液后，T-AOC 指標出現(xiàn)了很大的提升，表明酶提羊肚菌子實體多糖對能夠顯著提升小白鼠的總抗氧化能力，具有明顯的抗氧化、抗衰老作用。

表4 羊肚菌酶提子實體多糖對小白鼠T-AOC、SOD、GSH-Px、MDA 指標的影響Tab.4 Effects of polysaccharides extracted from Morchella spp. fruiting body on T-AOC, SOD, GSH-Px, MDA indexes of mice

2.3 對血清生化指標的影響

試驗測定酶提羊肚菌子實體多糖對小白鼠血清中谷丙轉氨酶（ALT） 谷草轉氨酶（AST） 含量變化如圖1 所示，尿素氮（BUN） 和肌酐（CRE） 含量變化如圖2 所示。

ALT 和AST 是肝臟受損的敏感檢測指標，肝細胞受損或死亡時會釋放ALT 和AST，導致血清中含量異常升高。從圖1 可以看出，與正常組相比，低劑量和高劑量組血清中ALT 和AST 活性均有所降低，反映出酶提羊肚菌子實體多糖對這兩項指標有明顯的抑制作用。ALT 活性指標低劑量組與正常組相比降低了44.62%，而高劑量組與低劑量組相比又降低了23.75%，達到了（42.57±4.03） U·L-1；AST 活性指標低劑量組與正常組相比降低了37.39%，而高劑量組與低劑量組相比又降低了3.64%，達到了（141.88±7.23） U·L-1。這說明給小白鼠灌注酶提羊肚菌子實體多糖溶液后，低劑量和高劑量對ALT 活性的影響較大，而不同劑量對AST 的影響較小，但都能不同程度的降低ALT 和AST 含量。

BUN 和CRE 是腎臟受損的檢測指標，BUIN 含量升高表明腎臟功能變壞，臨床反映就是腎功能不全，BUN 過高已經(jīng)成為尿素癥的重要診斷指標。CRE 是一種肌肉代謝產(chǎn)物，輕微的CRE 升高并不能一定是腎功能問題，但如果CRE 明顯升高，一般臨床上表示早期的腎功能異常。從圖2 的試驗結果可以看出，與正常組相比，低劑量和高劑量組血清中BUN 和CRE 活性均有所降低，但CRE 變化明顯，BUN 基本持平，說明酶提羊肚菌子實體多糖對這CRE 含量影響顯著，但對BUN 影響不大。

BUN 活性指標低劑量組與正常組相比降低了34.68%，而高劑量組與低劑量組相比降低了5.84%，達到了（5.48±0.34） mmol·L-1；CRE 活性指標低劑量組與正常組相比降低了24.29%，而高劑量組與低劑量組相比又降低了22.77%，達到了（57.03±4.52） mmol·L-1。試驗結果顯示酶提羊肚菌子實體多糖對能降低血清中的BUN 和CRE 含量，增加劑量對BUN 含量影響不大，但高劑量會顯著降低CRE 的含量。

3 結論

通過急性毒性試驗，用不同濃度的酶提羊肚菌子實體多糖溶液連續(xù)灌胃小白鼠1 周，在濃度上限1 800 mg·kg-1時小白鼠未出現(xiàn)中毒癥狀，也無異常行為。

試驗結果表明，酶提羊肚菌子實體多糖可以提高小白鼠的抗氧化和抗衰老能力，對小白鼠的肝臟、腎臟等臟器具有一定的保護作用，并且與酶提羊肚菌子實體多糖的劑量有一定的關系。后續(xù)將對比其它食用菌多糖與酶提羊肚菌子實體多糖的功效，同時羊肚菌多糖的提純和抗疲勞作用機理開展研究，為我國羊肚菌資源的開發(fā)利用提供參考。