胡舜琪，張其琛，李熙雷

復旦大學附屬中山醫(yī)院骨科，上海 200032

椎間盤退行性變（IDD）被公認為是腰痛的主要原因，約有80%的人會在其一生中遭遇到腰痛［1］。目前，世界上約有6.5億人受到腰痛的困擾，僅在美國，每年投入的相關費用就超過了300億美元，甚至超過了中風、呼吸道感染、糖尿病、冠狀動脈疾病及類風濕疾病的費用總和［2］。腰痛已是導致患者住院治療的第二大常見病因，也是導致患者長期殘疾的主要原因之一［3］。此外，IDD還是頸部和背部疼痛綜合征的主要原因，嚴重情況下甚至會造成患者殘疾［4］。隨著人口老齡化的日漸加重，IDD對人類健康造成巨大危害，也給患者家庭和社會增加了沉重的經(jīng)濟負擔。作為一種常見的復雜退行性疾病，其傳統(tǒng)治療措施已無法滿足目前的臨床需求。自噬細胞保護效應引起學者們的關注。椎間盤髓核細胞通過自噬適應外界環(huán)境，維持細胞穩(wěn)態(tài)。適度激活自噬能有效抑制椎間盤細胞凋亡，延緩細胞外基質(zhì)（ECM）降解。研究自噬在IDD中的作用機制，針對性地干預其病理生理進程，可為IDD的臨床治療提供新的理念。本文通過查閱近年自噬對IDD作用的相關文獻，從IDD及自噬的發(fā)生機制、髓核細胞凋亡途徑及自噬對髓核細胞凋亡的作用機制等方面展開分析，綜述如下。

1 IDD的發(fā)生機制

目前，IDD的治療主要依靠手術緩解神經(jīng)受壓，有一定的療效，但無法從根本上預防或逆轉(zhuǎn)IDD的發(fā)生和發(fā)展［5］。面對現(xiàn)有治療的局限性，深入研究IDD的發(fā)生機制，尋找新的解決方案成為迫切需求。椎間盤活性細胞數(shù)量的減少和ECM的降解是IDD的主要特征。在健康的椎間盤中，由于受到生長因子和細胞因子的復雜調(diào)控，ECM的合成和分解代謝處于相對平衡的狀態(tài)；一旦ECM的分解代謝超過合成代謝，就容易發(fā)生IDD。IDD的發(fā)生機制非常復雜，常由多個因素引起，如異常的機械負荷、性別、年齡、吸煙、創(chuàng)傷和遺傳等［6-9］。健康的椎間盤需要維持細胞穩(wěn)態(tài)，當細胞穩(wěn)態(tài)由于上述因素被破壞時，在分子水平上會發(fā)生分解代謝的級聯(lián)反應，進而導致促炎因子水平上調(diào)、基質(zhì)降解酶增加和基質(zhì)蛋白喪失，加劇IDD發(fā)展，甚至導致神經(jīng)血管向椎間盤內(nèi)生長，引起疼痛癥狀［10］。研究表明，ECM中的膠原蛋白和蛋白多糖的喪失在IDD的發(fā)展中起到關鍵作用，ECM的分解過程由基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）和血小板反應蛋白解聚素樣金屬蛋白酶（ADAMTS）引起［11］，該過程被認為由腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1β（IL-1β）等促炎因子介導，其上調(diào)了MMPs和ADAMTS的表達［12］。在這些分子中，MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4及ADAMTS-5是降解基質(zhì)成分的典型代表，已被證實在發(fā)生退行性變的組織中高表達并參與了正常細胞的轉(zhuǎn)化和椎間盤主要結(jié)構成分的病理性退行性變［13］。此外，椎間盤細胞的死亡，尤其是髓核細胞的凋亡也會導致ECM的合成與分泌減少。

2 自噬的發(fā)生機制

自噬是細胞的自我消化，是一種進化上極為保守的分解代謝過程，最早由De Duve［14］于1963年提出。自噬分為3種形式：巨自噬、微自噬及分子伴侶介導的自噬（CMA）。一般所說的自噬即為巨自噬。自噬是細胞的一種自我保護機制，通過該機制，在不利的外界條件下，例如營養(yǎng)缺乏、氧化應激等，細胞中受損的細胞器或長壽命蛋白可以被雙層膜囊泡隔離并帶到溶酶體中降解。自噬在所有細胞中以較低的基礎水平存在來維持細胞穩(wěn)態(tài)，如更新細胞器；當細胞需要產(chǎn)生營養(yǎng)、能量（如饑餓或營養(yǎng)因子缺乏）或需要迅速清除有害的細胞質(zhì)中的成分（如在氧化應激或感染期間），自噬水平會快速上調(diào)。細胞通過自噬來降解非必需蛋白質(zhì)和細胞器，以供細胞重新回收利用，再合成細胞所需的大分子和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）［15］。在不同的應激下，細胞依靠自噬清除功能失調(diào)或過剩的細胞器來維持細胞穩(wěn)態(tài)［16］。自噬的過程可分為以下幾個步驟。

2.1 自噬的起始與成核

自噬的激活途徑包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）依賴性途徑（如AMPK/mTOR和PI3K/Akt/mTOR）以及非mTOR依賴性途徑（如p53）。自噬的特異性和復雜的分子機制尚未完全闡明，已被認為有超過35種自噬相關基因（ATGs）參與自噬的調(diào)控［17］。在哺乳動物中，mTOR的下調(diào)受到應激的刺激，隨后激活下游的絲氨酸/蘇氨酸Unc-51樣激酶1（ULK1）和ULK2（ATG1在哺乳動物中的2個同源物）。激活的ULK1/2與ATG13、FIP2000（ATG17在哺乳動物中的同源物）和ATG101形成ULK1復合物，通過激活Ⅲ類磷脂酰肌醇3激酶（PI3KC3）復合物來調(diào)控自噬體的形成［18］。PI3KC3復合物通過磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）的產(chǎn)生來募集效應蛋白，形成歐米茄體，即自噬前體（PAS）作為成核位點［17］。

2.2 自噬體膜的擴增和延伸

PI3KC3復合物定位于吞噬泡并進一步募集ATGs以完成自噬體的發(fā)育。吞噬泡的延伸會受到2種泛素樣結(jié)合系統(tǒng)的調(diào)控：①ATG5-ATG12復合物與ATG16L1結(jié)合，產(chǎn)生定位于膜外表面的復合物，稱為ATG16L復合物［19］。ATG12通過E1樣酶ATG7和E2樣酶ATG10與ATG5共價結(jié)合，得到的ATG5-ATG12復合物被募集到自噬體膜并通過與ATG16L1的相互作用促進其延伸［20］。②涉及微管相關蛋白1輕鏈3（LC3），其為酵母中ATG8的同源物。早期合成的無活性proLC3（LC3的未加工形式）被ATG4B裂解，形成可溶性的LC3-Ⅰ，從而暴露其C末端的甘氨酸基團［21］。LC3-Ⅰ的C末端甘氨酸基團與磷脂酰乙醇胺（PE）的特異性氨基酸位點緊密結(jié)合，形成LC3-PE復合物，這種形式的LC3被稱為膜結(jié)合的LC3-Ⅱ［22］。蛋白質(zhì)免疫印跡法分析LC3-Ⅱ水平的變化或監(jiān)測細胞中GFP-LC3的分布是測定自噬水平最常用的方法［23］。PE的高親脂性促進LC3-Ⅱ募集自噬體，在自噬體的延伸中起到了決定性作用［24］。這2種系統(tǒng)對自噬發(fā)生均不可或缺。ATG16L復合物作為一種新型E3樣酶，對LC3的脂質(zhì)化起到了支架作用，最終促進自噬體形成［19］。

2.3 自噬溶酶體的形成及內(nèi)容物降解

隨著膜的擴增和封閉，自噬體逐漸成熟。當自噬體完全封閉底物，就可與溶酶體融合，形成自噬溶酶體。自噬體與溶酶體融合之后，位于自噬體膜外的LC3-Ⅱ通過ATG4與PE解偶聯(lián)，形成LC3-Ⅰ并被釋放到細胞質(zhì)中進行再次循環(huán)，而定位于自噬體膜內(nèi)的LC3-Ⅱ最終被自噬溶酶體的酸性水解酶迅速降解。

3 髓核細胞凋亡途徑

細胞凋亡的研究主要集中在3種凋亡信號通路：線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。Wang等［25］的研究證實，在發(fā)生退行性變的椎間盤組織中，以上3種途徑共同導致了細胞凋亡的發(fā)生。在IDD發(fā)展的輕度階段，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑介導的髓核細胞凋亡占主導地位；死亡受體途徑則在輕度、中度IDD中發(fā)揮主要作用；線粒體途徑在重度IDD中起到更關鍵的作用。

這3條凋亡路徑相互之間也存在著密切的分子交聯(lián)。Caspase-8連接死亡受體和線粒體途徑［26］；p53也可以通過上述的2個途徑起作用［27］，在間接的線粒體途徑中，p53導致細胞質(zhì)的Fas在細胞表面重新分布，并上調(diào)Fas表達，而Fas是死亡受體途徑中的重要分子。在直接線粒體途徑中，p53上調(diào)Bax并使功能性Bax和Bcl-x復合物解離［28］，因此，死亡受體和線粒體途徑也通過p53連接。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和線粒體途徑可以通過GADD153和caspase-9聯(lián)系［29］。盡管這3種途徑存在許多交聯(lián)，但死亡受體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的特異性標志物各不相同，分別是Caspase-8、Cytc和Caspase-4。髓核細胞的凋亡發(fā)生率隨著IDD的進展而增加，在IDD過程中，每個凋亡路徑在IDD的不同階段發(fā)揮不同作用。

4 自噬對髓核細胞凋亡的作用機制

在成年人的正常椎間盤中幾乎沒有血管存在，并且髓核細胞在椎間盤中處于極度缺氧的狀態(tài)（中心的髓核氧濃度僅為1%）［30］，因此，椎間盤本身易發(fā)生退行性變。若存在非生理性的機械負荷及其他生理生化因素的刺激（如衰老、尼古丁、炎性因子等），就會誘導椎間盤細胞的凋亡，而大量凋亡的髓核細胞和ECM的分解產(chǎn)物則可進一步促進髓核組織中炎性因子的增加［31-32］，形成惡性循環(huán)。髓核細胞是存在于椎間盤髓核中的主要細胞類型，負責合成ECM成分，例如Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖，這些蛋白是椎間盤主要的功能組成部分。不僅凋亡的髓核細胞無法合成ECM，在椎間盤中經(jīng)歷退行性變過程的存活細胞也無法合成正常的ECM［33］。有研究顯示，在細胞水平，凋亡與IDD密切相關，如在老化的椎間盤中，髓核組織的凋亡率顯著增加［34］。因此，與凋亡相關的髓核細胞減少是IDD的起始觸發(fā)因素，如何有效地抑制髓核細胞的凋亡是解決問題的關鍵。

研究表明，自噬與細胞死亡密切相關，與自噬有關的細胞死亡被細胞死亡命名委員會（NCDD）稱為“自噬性細胞死亡”［35］。事實上，自噬性細胞死亡和凋亡均屬于程序性細胞死亡（PCD）的范疇［36］。從分子機制層面看，自噬也與細胞凋亡存在著復雜緊密的聯(lián)系。Beclin-1是酵母自噬相關基因6（ATG6）的哺乳動物同源物，在自噬過程中發(fā)揮關鍵作用，已有證據(jù)顯示，抗凋亡因子B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）基因可通過結(jié)合Beclin-1的BH3結(jié)構域抑制自噬［37］。此外，ATG12和ATG5在不同應激信號引起的細胞凋亡的啟動中扮演了重要角色［38］。自噬能否影響椎間盤中的細胞凋亡，引起了學者們的極大興趣。

研究發(fā)現(xiàn)，自噬在未發(fā)生退行性變的大鼠椎間盤髓核細胞中存在著一定的基礎水平，而在發(fā)生退行性病變的髓核組織中細胞自噬顯著增高或降低，說明自噬在正常髓核細胞及不同病理因素背景下發(fā)揮不同的作用［4］。

Jiang等［39］的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖胺可通過PI3K/Akt/mTOR通路激活自噬，在10 mmol/L葡萄糖胺的濃度下，炎性因子IL-1β處理過的髓核細胞的Caspase3/pro-caspase3顯著降低，說明髓核細胞的凋亡被該濃度下葡萄糖胺所誘導的自噬抑制。然而在高濃度葡萄糖胺下，自噬被過度激活，引起髓核細胞自噬性細胞死亡；另外，用自噬抑制劑3-MA可以使細胞凋亡加劇。這說明中等程度的自噬激活有利于髓核細胞的生存，過低或過高水平的自噬均會加劇髓核細胞的死亡。

同時有研究顯示，外界刺激持續(xù)作用的時間也會通過自噬影響髓核細胞的活力。Ma等［40］通過壓縮誘導髓核細胞自噬，隨著暴露于壓縮刺激的時間延長，自噬增加，凋亡水平也呈時間依賴性增加。這說明外界持續(xù)刺激誘導的長期自噬不利于細胞存活。Chang等［41］的研究發(fā)現(xiàn)，通過葡萄糖剝奪，早期（0 ～ 6 h）由少量活性氧類（ROS）產(chǎn)生所誘導的自噬對細胞的保護起到關鍵作用，在晚期階段（12 ～ 24 h）過量的ROS累積反而造成細胞器的損傷，此時自噬的保護作用無法與之抗衡，導致髓核細胞凋亡增加。有學者認為，自噬引起的細胞內(nèi)資源的過度消耗也可能是導致細胞死亡的一個重要原因［42］。

自噬激活的作用效果也與椎間盤本身的退行性變程度有關。Miyazaki等［43］的研究發(fā)現(xiàn)，自噬在PfirrmannⅣ級椎間盤中抑制凋亡的效果比PfirrmannⅡ級更明顯，而且自噬在晚期退行性變的椎間盤中的作用比在早期更為突出。因此，可以推斷，退行性變程度越高的椎間盤，其細胞對自噬激活的敏感性可能更高。由此可見，自噬對髓核細胞而言是一把雙刃劍，是髓核細胞存活和死亡之間的轉(zhuǎn)換器。自噬的適度激活有利于改善髓核細胞活力，減少髓核細胞在不利應激下的凋亡率。

5 總 結(jié)

IDD的傳統(tǒng)治療已無法滿足患者對預后的期望和對生活質(zhì)量的需求。近年來，自噬作為一個科研熱點引起了廣泛的關注和深入探索。目前，大部分研究依然處于體外試驗階段，其確切的臨床效果尚有待驗證。如何將椎間盤細胞的自噬水平調(diào)控至最佳以最大程度降低細胞凋亡，是臨床應用的重大挑戰(zhàn)，但可以預見的是，以自噬相關通路作為靶點的療法，將為IDD的臨床治療提供更多的選擇。