邢曉軻
(許昌職業(yè)技術學院 園林與食品工程學院,河南 許昌 461000)
曲是糧食或糧食加工副產(chǎn)品時通過培養(yǎng)微生物制成的一種含有大量活菌體及其酶類的發(fā)酵劑。酒曲是釀酒生產(chǎn)過程中糖化、發(fā)酵、酒化和生香等工藝所用的試劑,其品質對出酒率和酒質有極大影響[1]。如果麩曲在釀造過程中不被分解利用,其殘渣會污染環(huán)境[2]。為了降低成本,減少環(huán)境污染,應用純種微生物來制取麩皮曲就成為研究熱點。
麩皮是小麥面粉廠的主要加工副產(chǎn)品,含有豐富的淀粉酶系、蛋白質、碳水化合物、維生素和礦物質等,每年產(chǎn)量可達2億 t以上,但大多數(shù)都沒有進行深加工和利用,麩皮中的各種營養(yǎng)成分有助于微生物及大曲中根霉的生長。因此,以麩皮為主要原料,蒸熟后接入純種霉菌,可以在人工控溫條件下培養(yǎng)麩皮曲且麩皮曲不論生料或熟料的酶活性都遠高于其他原料。常采用經(jīng)蒸煮滅菌后接入曲種熟料的方法制得麩皮曲,該方法具有糖化發(fā)酵力強、原料利用率高、生產(chǎn)周期短等特點[3]。與純種霉菌制成的麩皮曲相比,采用混合麩皮曲釀酒能顯著改善酒的品質[4]。為了提高麩皮曲中酶的活力,本文利用響應面法對麩皮曲的配方進行優(yōu)化,為麩皮曲的進一步開發(fā)應用奠定基礎。
麩皮、稻殼:市售。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、蛋白胨購自杭州天和微生物試劑有限公司。磷酸二氫鉀、硫酸鎂、葡萄糖、可溶性淀粉、磷酸二氫鈉、3,5—二硝基水楊酸均為分析純,購自天津市大茂化學試劑廠。
YP30002電子天平,上海佑科儀器儀表有限公司;T6新悅可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;DK-8D電熱恒溫水浴鍋,常州普天儀器制造有限公司;LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器,上海審安醫(yī)療器械廠;SPX-25-Z恒溫培養(yǎng)箱,上海博泰試驗設備有限公司;JBZL-D8恒溫振蕩培養(yǎng)箱,常州普天儀器制造有限公司;SW-CJ-2FD凈化工作臺,蘇州凈化設備工程有限公司。
準確稱取2 g葡萄糖(干燥至恒重),用蒸餾水溶解后,置于1 000 mL容量瓶中定容。取6支試管分別編號,在每支試管中加入葡萄糖原液和蒸餾水,并在各試管中加入1.5 mL 3,5—二硝基水楊酸溶液搖勻,于沸水浴中加熱5 min,常溫晾置,然后加入10 mL蒸餾水,在540 nm波長下依次測定吸光度。以葡萄糖的梯度溶液為橫坐標,以吸光度為縱坐標,繪制標準曲線[5]。
按每100 kg麩皮拌入5~10 kg稻殼和30~32 kg水的比例,拌勻后放入蒸料罐,通汽加熱至罐內壓力達0.1 MPa時開始計時,持續(xù)30 min,停止加熱,排汽出料。
將熟料出罐后攤晾至35~40 ℃,按照每50 kg麩皮拌入20 g菌種的比例進行接種,先接入部分熟料拌勻,然后繼續(xù)撒熟料并摻拌均勻,最后打碎料塊,移入曲池。
曲料入池后,攤平,在4~5 h內保溫保濕,不用通風。4~5 h后,曲料溫度上升至34~35 ℃,通風降溫,間歇開停。10~12 h以后,曲料開始結塊,空氣通透性差,連續(xù)通風,或適當打開冷風門,以保持曲料溫度在36~38 ℃,防止曲料失水過快。18~20 h以后,菌絲生長緩慢,此時應注意降低曲料溫度,并提高室溫,保持曲料溫度在35~38 ℃,以利于酶的形成和積累,便于成曲存放。
成熟的麩曲即可用于制醅發(fā)酵。如有剩余,可放在潔凈陰涼干燥處,攤成5 cm左右的薄層,晾干備用。
曲料入池時,要松散均勻,以利于曲霉孢子發(fā)芽和通風。當曲料溫度過高時,要及時采取降溫措施,防止燒曲。在前期間斷通風階段,要做到兼顧降溫保濕;在中期連續(xù)通風階段,要注意控制曲料溫度不高于36~38 ℃;在后期,要提高室溫排除潮氣,使成曲水分保持在30%以下。由于成曲不易儲存,所以最好邊生產(chǎn)邊使用。成曲含水分較多,容易升溫,導致酶喪失活力,所以即使是干曲也不宜久存。
糖化酶是一種外切型糖苷酶,是白酒微生物的主要代謝產(chǎn)物之一,其活力是衡量麩曲質量的重要指標[6]。取1 mL質量分數(shù)為1.33%的可溶性淀粉溶液,在60 ℃水浴中先預熱5 min,加入1 mL酶液(取1 g絕干曲稀釋30倍,靜置30 min),然后在60 ℃下水浴反應10 min,立即加入1.5 mL 3,5—二硝基水楊酸溶液,沸水水浴5 min,冷卻后加10 mL蒸餾水,搖勻后在540 nm波長處測吸光度。干曲的糖化酶活力值的計算公式為:
(1)
式(1)中,C為由葡萄糖標準曲線查得的葡萄糖含量(mg/mL);V為糖化原料總體積(mL);N為酶液稀釋倍數(shù);M為干曲質量(g);t為糖化時間(h)。
1.9.1Plackett-Burman實驗設計
種子培養(yǎng)時間、麩皮曲培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、稻殼量、接種量、加水量等都會對微生物的種群數(shù)量和酶的活性有影響。因此,本文采用以上因素2水平部分因子設計方法,即Plackett-Burman實驗(PB實驗)[7]。
1.9.2最陡爬坡實驗
響應面擬合方程只有在考察的緊接領域才能充分接近真實情形,所以要想建立有效的響應面擬合方程,就必須先接近最佳值區(qū)域,因此本實驗采用最陡爬坡法[7]。
1.9.3響應面分析法
為了進一步研究相關變量之間的交互作用,并最終確定最優(yōu)點,采用響應面分析法進行直觀分析。將沒有顯著性影響的自變量設為零,觀察具有顯著性影響因素間的交互作用[8],然后采用中心復合實驗,對評價指標和因素間的非線性關系進行評估。
研究發(fā)現(xiàn)影響麩皮曲酶活力大小的因素有6個,分別為:種子培養(yǎng)時間、麩皮曲培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、稻殼量、接種量、加水量。設計Plackett-Burman實驗,實驗次數(shù)N=12,對上述6個因素進行觀察,每個因素分2個水平,響應值為麩皮曲的酶活力值。
Plackett-Burman實驗設計及響應值見表1。利用軟件對實驗各因素的主效應進行分析,Plackett-Burman實驗因素水平及其主效應分析見表2。由Minitab軟件對PB實驗的設計結果進行主效應分析,Plackett-Burman實驗因素水平及其主效應分析結果如圖1所示。由此可以看出,麩皮曲培養(yǎng)時間和種子培養(yǎng)時間對麩皮曲的酶活力值的影響最為明顯。因此,以這2個主要影響因素為基礎進行下一步實驗。
表1 Plackett-Burman實驗設計及響應值(N =12)
表2 Plackett-Burman實驗因素水平及其主效應分析
圖1 Plackett-Burman實驗因素水平及其主效應分析結果
以Plackett-Burman實驗結果為基礎進行最陡爬坡路徑實驗。表2中的麩皮培養(yǎng)時間具有顯著的正效應,種子培養(yǎng)時間具有顯著的負效應。按照這2個因素的效應比例設定變化方向和步長,其他4個因素分別取各自的低水平進行實驗。最陡爬坡實驗設計及結果見表3。由表3可以看出,最佳因素條件處于第3組和第4組之間,所以將第3組條件作為后續(xù)實驗的中心點進行響應面分析。
表3 最陡爬坡實驗設計及結果
通過Plackett-Burman實驗確定了影響麩皮曲酶活力值的主要因素,然后利用最陡爬坡實驗確定接近響應值區(qū)域的影響因素濃度,最后進行響應面分析。重要因素水平及實驗設計見表4,其他4個因素分別取各自的低水平進行實驗。
表4 重要因素水平及實驗設計
通過響應面法繪制分析圖,考察所擬合的相應曲面的形狀。酶活力值與麩皮曲培養(yǎng)時間、種子培養(yǎng)時間的響應面等值線圖如圖2所示,相應的響應面立體分析圖如圖3所示。由圖2~3可以看出,響應面存在穩(wěn)定點,即極大值;經(jīng)過嶺嵴分析獲得極大值,即種子培養(yǎng)時間和麩皮曲培養(yǎng)時間的最佳時間分別為33.685 7 h和30.128 6 h,此時麩皮曲的酶活力值達到最大,為127.814 2 mg/(h·g)。
圖2 響應面等值線圖
圖3 響應面立體分析圖
以種子培養(yǎng)時間和麩皮曲培養(yǎng)時間為主要因素,軟件分析出響應面存在的穩(wěn)定點,以得出的麩皮曲的最優(yōu)配方做驗證實驗,進行3次平行實驗,研究結果發(fā)現(xiàn),麩皮曲酶活力值分別為130.58 mg/(h·g),133.42 mg/(h·g),122.35 mg/(h·g),3次結果的平均值為128.78 mg/(h·g),與預測值127.81 mg/(h·g)非常接近,且與原始麩皮曲酶活力值99.17 mg/(h·g)相比,提高了29.9%。
利用響應面分析法對麩皮曲配方進行優(yōu)化,首先用Plackett-Burman法確定出種子培養(yǎng)時間和麩皮曲培養(yǎng)時間為主要影響因素;然后通過最陡爬坡實驗逐步改變二者數(shù)值,逼近最佳響應面區(qū)域;最后用中心復合實驗及Minitab軟件分析出主要影響因素的最優(yōu)數(shù)值。麩皮曲配方的最佳培養(yǎng)條件為:種子培養(yǎng)時間為33.685 7 h,麩皮曲培養(yǎng)時間為30.128 6 h。按照此條件來培養(yǎng)麩皮曲,酶活力值達到了128.78 mg/(h·g),與原始麩皮曲配方相比提高了29.9%。這為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)麩皮曲奠定了理論基礎。