劉彥敏，沈 璐，王 康，嚴(yán)金平，伊日布斯

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500）

納豆是大豆經(jīng)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵而成的一種傳統(tǒng)食品。1906年Swamula[1]首次從納豆中篩選到了枯草芽孢桿菌屬的新型菌株，將其命名為納豆芽孢桿菌（B. subtilis natto）。納豆芽孢桿菌可合成納豆激酶，生產(chǎn)以聚谷氨酸（poly-L-glutamic acid，γ-PGA）為成分的黏性物質(zhì)，以及具有生物缺陷型特性，以上特點(diǎn)是其區(qū)別于其他枯草芽孢桿菌的主要性狀[2-3]。因其芽孢結(jié)構(gòu)具有耐受各種環(huán)境迫的能力[4]，能在腸道中定植生長，促進(jìn)機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的分解與吸收。同時納豆芽孢桿菌發(fā)酵的納豆還具有溶解血栓、降血壓、預(yù)防骨質(zhì)疏松、抗氧化和增強(qiáng)機(jī)體的免疫等功能[5]。

1987年Sumi等[6]首次從納豆中純化出納豆激酶，并在后續(xù)研究中證明了納豆激酶具有溶解血栓、降低血黏度、改善血液循環(huán)、軟化和增加血管彈性等作用。從納豆及納豆芽孢桿菌引起了前所未有的關(guān)注。國內(nèi)外的科研工作者陸續(xù)從傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品中篩選到了產(chǎn)納豆激酶菌株。Jeong等[7]從韓國傳統(tǒng)豆醬（doenjang）中篩選到產(chǎn)γ-PGA、α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶并可發(fā)酵低鹽豆醬的菌株D2-2和D12-5。我國學(xué)者也從中國的傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中篩選到了高產(chǎn)納豆激酶、拉絲效果良好、具有光抗菌活性和熱穩(wěn)定性的納豆發(fā)酵菌株[8-12]。董明盛等[13]從中國豆豉中篩選到有明顯纖溶活性的納豆芽孢桿菌株NK-5，試制的納豆在4 ℃貯存兩個月仍能保持70%納豆激酶活力。王成濤等[14]從中國的24 種豆制品中篩選到高產(chǎn)纖溶酶的菌株BN-6，纖溶酶活性達(dá)900 U/mL。

枯草芽孢桿菌廣泛分布于自然界的不同環(huán)境中，研究證明其16S rRNA基因序列不能明確區(qū)分其不同表型性狀的亞種和菌株，Qin Huibin[15]和Xu Dong[16]等利用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（internal transcribed spacer，ITS），對枯草芽孢桿菌種內(nèi)的不同菌株進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。

目前，我國的納豆生產(chǎn)菌株依賴進(jìn)口，工業(yè)菌株和生產(chǎn)工藝的開發(fā)滯后，再加上我國消費(fèi)者對納豆感官的不適應(yīng)等問題嚴(yán)重限制了我國納豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。我國傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品歷史悠久，但對大豆發(fā)酵食品的發(fā)酵菌株和功能菌株的研究還較少。本研究以蛋白酶、納豆激酶、產(chǎn)γ-PGA性能和生物依賴特性為篩選指標(biāo)，從傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品和稻草中分離獲得8 株具有典型納豆芽孢桿菌特性的枯草芽孢桿菌菌株，進(jìn)行形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析，進(jìn)一步通過納豆發(fā)酵實(shí)驗(yàn)獲得具有納豆激酶活性、感官效果良好的本地化納豆食品，以期獲得有良好的商業(yè)化前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆醬由河南省新鄉(xiāng)市家庭自制；豆豉由云南省騰沖市家庭自制；稻草 云南省玉溪市農(nóng)家。

1.1.2 參考菌株

市售納豆發(fā)酵劑中純化的菌株B. subtilis natto NR（簡稱NR） 日本成瀨發(fā)酵化學(xué)研究所；市售納豆發(fā)酵劑中純化的菌株B. subtilis natto MG（簡稱MG） 日本宮城野納豆制作研究所；市售納豆發(fā)酵劑中純化的菌株B. subtilis natto KT（簡稱KT） 日本高橋保藏研究所；B. subtilis 168菌株（簡稱168，不能產(chǎn)納豆的枯草芽孢桿菌，作為納豆發(fā)酵的負(fù)對照菌株） 廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

NBP培養(yǎng)基：1%牛肉膏、1%大豆蛋白胨、0.5% NaCl、2%瓊脂，pH 7.0。

蛋白酶活性菌株篩選的培養(yǎng)基（脫脂奶培養(yǎng)基）：10%脫脂奶、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl、2%瓊脂，pH 7.2～7.4。

產(chǎn)細(xì)胞外黏性多糖菌株篩選的培養(yǎng)基（GSP培養(yǎng)基）：3%蔗糖、1.5%大豆蛋白胨、0.25% KH2PO4、0.17% Na2HPO4、0.05% NaCl、0.05% MgCl2g 7H2O、1.5%一水合谷氨酸鈉、100 μg/L生物、2%瓊脂。

Taq Buffer、dNTP、Taq酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司；尿激酶 上海源葉生物科技有限公司；纖維蛋白酶原、凝血酶（100 U/mL） 西格瑪奧德里奇 （上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PH104A恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；4802UV/VIS紫外-可見光分光光度計 尤尼科儀器有限公司；G154DW高壓蒸汽滅菌鍋 至微儀器有限公司；DM顯微鏡 徠卡儀器（德國）有限公司；RH basic 2磁力攪拌器 德國IKA公司；SSW-420-2S恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；THZ-072HT控溫?fù)u床 上海申能博彩生物科技有限公司；2720 Thermal Cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Heraeus Fresco 17R臺式低溫高速離心機(jī) 美國賽默飛世爾科技 （中國）有限公司；干式恒溫器 杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 納豆芽孢桿菌的初篩

分別稱取2 g河南豆醬、騰沖豆豉和玉溪稻草（稻草剪切成1 cm長的片段）加入50 mL 0.09%的滅菌生理鹽水中，室溫攪拌10 min后，80 ℃金屬浴加熱20 min。冷卻至室溫，進(jìn)行系列梯度稀釋，稀釋后取104、105、 106、107、108五個梯度分別涂布于NBP瓊脂培養(yǎng)基上，每個梯度做3 個平行。涂布的平板37 ℃培養(yǎng)48 h后，挑取平板上獨(dú)立的菌落于NBP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)備用。

1.3.2 納豆芽孢桿菌的復(fù)篩

表 1 復(fù)篩的評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Grading criteria for rescreening

1.3.3 納豆芽孢桿菌的初步鑒定

1.3.3.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察觀察并記錄菌落特征；對篩選菌株的活菌和芽孢進(jìn)行染色，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)[17]。

1.3.3.2 納豆芽孢桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

提取所篩菌株的基因組D N A 作為P C R 模板。合 成1 6 S r R N A 和I T S 引 物[15]（由B i o s u n e 公 司 合成），引物序列如表2所示；PCR采用25 μL體系：10h PCR Buffer 2.2 μL；dNTPs（2.5 mmol/L）2.5 μL；ddH2O 17.5 μL；上下游引物（10 μmol/L）分別為0.5 μL；DNA模板1 μL；Taq酶0.5 μL。16S rRNA的PCR設(shè)定程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸75 s，共30 個循環(huán)；ITS的PCR設(shè)定程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個循環(huán)；使用無菌的ddH2O作為性對照。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，經(jīng)純化回收后交由Biosune公司測序。使用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST程序?qū)y序的16S rRNA、ITS基因序列進(jìn)行同源性比對，并用MEGA 7.0軟件通過Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

表 2 PCR擴(kuò)增引物序列Table 2 Sequences of primers used for PCR amplification

1.3.4 分離菌株發(fā)酵的納豆粗酶液中納豆激酶活性分析

1.3.4.1 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

參考Kim[19]和Astrup[20]等的方法，配制纖維蛋白平板。取2.5 mL纖維蛋白原（溶解于pH 7.4、0.1 mol/L 磷酸鹽鈉緩沖液）、0.1 mL凝血酶（100 U/mL）和7.4 mL 1 g/100 mL瓊脂糖溶液加入到直徑為9 cm的無菌平板中，小心振蕩，混勻，室溫放置30 min，打孔備用。分別取2 μL 200、400、600、800、1 000 U/mL的尿激酶，每個濃度做3 個平行，點(diǎn)于纖維蛋白平板的孔中，37 ℃溫育8 h后，用游標(biāo)卡尺測量水解圈直徑，并計溶解圈的平均面積。以溶解圈面積（mm2）為橫坐標(biāo)，尿激酶濃 度（U/mL）為縱坐標(biāo)，繪制尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2 納豆粗酶液中的納豆激酶活性測定

使用MG、NR、TK、168、HN72、HN10、HN48、HN35、HN67、TC100、TC103、DC21作為發(fā)酵劑，制作納豆。稱取2 g制作的納豆加入6 mL滅菌生理鹽水中，4 ℃靜置提取24 h或30 ℃振蕩提取30 min，4 ℃、10 000h g離心10 min，取2 μL上清粗酶液點(diǎn)于纖維蛋白平板的孔內(nèi)，每個品做3 個平行，37 ℃溫育8 h；用游標(biāo)卡尺測量溶解圈直徑，并計出溶解圈的平均面積；根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計所獲菌株制作納豆粗酶液的納豆激酶活性。

1.3.5 納豆發(fā)酵工藝及感官評價

參考奚銳華等[21]優(yōu)化的納豆生產(chǎn)工藝。納豆的制作流程設(shè)計如下：

1.3.5.1 納豆發(fā)酵方法及要點(diǎn)

1）制備種子發(fā)酵液：活化2 代的菌株接種于NBP液體培養(yǎng)基中，37 ℃、170 r/min培養(yǎng)16 h；2）挑選大豆：挑選粒度小而均勻的大豆；3）清洗：用自來水清洗大豆表面的沙土、塵埃和有機(jī)物；4）浸泡：20 ℃自來水浸泡16 h（對浸泡前、后的10 粒大豆質(zhì)量為2.3 倍為準(zhǔn)，稱質(zhì)量并記錄）；5）蒸煮：稱取25 g浸泡后的大豆裝入滅菌容器中（蓋有可透氣的濾膜）；121 ℃（0.1 MPa）蒸煮30 min；6）接種與發(fā)酵：活化好的種子液濃度調(diào)到1h 104CFU/mL后接種，39 ℃發(fā)酵18 h至大豆表面布滿致密白色粉末狀物質(zhì)；7）后熟：4 ℃后熟24 h。

1.3.5.2 感官評價

采用4 個指標(biāo)的5 分制進(jìn)行評分（表3）。由10 人組成感官評價小組，采取盲評模式，去掉1 個最高分和1 個最低分，實(shí)驗(yàn)設(shè)計者不參與評分，取8 個得分的平均值。其中納豆的拉絲評分是將納豆均勻攪拌2 min后，觀測黏液的量，然后用筷子挑起，以10 cm為一單位，從中間挑起，垂直拉絲10 cm為單位，再從拉起10 cm中挑起，依次重復(fù)進(jìn)行，直至拉斷。

表 3 感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Criteria for sensory evaluation

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，利用Microsoft Office Excel 2010對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌的篩選

表 4 8 株菌株的篩選結(jié)果Table 4 Screening results of 8 strains

2.2 分離菌株的鑒定

2.2.1 分離菌株的形態(tài)學(xué)特征

圖 1 8 株所獲菌株的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果Fig. 1 Morphological observations of 8 selected strains

如圖1所示，菌落表面呈乳白色或微黃色，濕潤，不透明，扁平有褶皺，菌落形態(tài)呈近圓形。革蘭氏陽性，細(xì)胞呈短桿狀，單個或鏈狀排列。在高溫、低溫、干燥、光線和化學(xué)藥物存的等不穩(wěn)定的條件下產(chǎn)生芽孢。具有枯草芽孢桿菌的形態(tài)學(xué)特征[17]。

2.2.2 分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

表 5 16S rRNA序列分析Table 5 Analysis of 16S rRNA sequences

使用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST程序進(jìn)行序列比對[22]的結(jié)果表明所獲8 株分離菌株的16S rRNA基因序列與枯草芽孢桿菌的不同菌株顯示最高的相似性均為100% （表5）。雖然與納豆芽孢桿菌為同一物種，但是這些同源性較高的菌株中沒有檢索到納豆芽孢桿菌。

圖 2 分離菌株與商業(yè)菌株及已知納豆芽孢桿菌的ITS系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 2 Phylogenetic tree of isolated strains, commercial strains and known strains of B. subtilis natto

2.3 分離菌株納豆粗酶液中的納豆激酶活性

根據(jù)Kim等[19]方法，使用纖維蛋白平板法測定納豆粗酶液中的納豆激酶活性。不同濃度尿激酶和不同菌株發(fā)酵的納豆粗酶液在纖維蛋白平板上反應(yīng)后都可見不同大小的溶解圈。尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=8.103 4x909.02（R2=0.995 4），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計所獲菌株發(fā)酵的納豆粗酶液的納豆激酶活性。結(jié)果顯示，所有品中，納豆粗酶液中納豆激酶活性最高的菌株是市售納豆芽孢桿菌株MG和KT，活性分別為 731 U/mL和898 U/mL；本研究從騰沖家庭自制豆豉中篩選到的2 株納豆芽孢桿菌TC100和TC103的納豆粗酶液中納豆激酶活性最強(qiáng)，分別為550 U/mL和519 U/mL；從玉溪稻草中篩選到的納豆芽孢桿菌DC21發(fā)酵的納豆粗酶液納豆激酶活性為483 U/mL；從河南豆醬中篩選到發(fā)酵納豆粗酶液中納豆激酶活性較高的菌株是HN67和HN72，活性分別為299 U/mL和231 U/mL；除HN10、HN48、HN35，其他菌株發(fā)酵的納豆粗酶液的納豆激酶活性都高于市售納豆芽孢桿菌株NR。HN10和HN48獲得的納豆粗酶液的溶解圈面積較小，超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的有效范圍，但肉眼能明顯觀測到它們的溶解圈（圖3）。

2.4 分離菌株的納豆發(fā)酵及感官評價

根據(jù)奚銳華等[21]的納豆生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，并制定納豆的感官評價方法。所獲8 株菌株均能成功發(fā)酵納豆（圖4），經(jīng)過感官評價（表6），結(jié)果顯示HN48、TC100菌株試制的納豆的感官評價分?jǐn)?shù)最高，均為19 分，和市售納豆納豆芽孢桿菌菌株（MG、KT、NR）發(fā)酵的納豆（感官評分20 分）感官差異較小，發(fā)酵的納豆有納豆香味、合成黏液多，拉絲長（30～40 cm），口感滑潤。

圖 4 納豆發(fā)酵樣品Fig. 4 Photographs of natto samples

表 6 試制納豆的感官評分結(jié)果Table 6 Sensory evaluation of natto samples

3 討 論

本研究根據(jù)納豆芽孢桿菌具有產(chǎn)蛋白酶、γ-PGA、納豆激酶和生物缺陷4 個篩選指標(biāo)[2-3]，從河南豆醬、騰沖豆豉和玉溪稻草品中的326 株產(chǎn)芽孢菌株中篩選到8 株：HN72、HN10、HN48、HN35、HN67、TC100、TC103、DC21。傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品經(jīng)原料和環(huán)境中微生物自然發(fā)酵而制成[23]，目前已有很多關(guān)于從傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中篩選得到納豆芽孢桿菌的 報道[6-7,10-11,24-25]。這些報道中大部分是根據(jù)納豆芽孢桿菌的一種或兩種特性，尤其是納豆激酶特性[26]為篩選指標(biāo)，容易導(dǎo)致篩選到的產(chǎn)納豆激酶菌株不能生產(chǎn)納豆或納豆生產(chǎn)效果不佳的問題。目前關(guān)于傳統(tǒng)豆醬和稻草中篩選獲得納豆芽孢桿菌的研究不多[25,27]，本研究根據(jù)納豆芽孢桿菌特性的4 個篩選指標(biāo)，從不同地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品和稻草中的產(chǎn)芽孢菌株中篩選到8 株具有納豆芽孢桿菌特征的菌株，并都能用于生產(chǎn)納豆。

根據(jù)分離菌株的形態(tài)特征和ITS序列分析鑒定了所獲8 個菌株為枯草芽孢桿菌的納豆芽孢桿菌亞種 （B. subtilis natto）?？莶菅挎邨U菌種內(nèi)16S rRNA基因序列相對保守，通常很難用于區(qū)分物種內(nèi)的不同表型性狀的菌株[28]。Qin Huibin等[15]利用ITS序列，對枯草芽孢桿菌種內(nèi)的不同菌株進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析[15]。本研究采用ITS序列分析分離菌株與枯草芽孢桿菌種群內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將采用16S rRNA不能區(qū)分的種內(nèi)關(guān)系有效區(qū)分出來[15,29]，結(jié)果顯示所篩菌株均是納豆芽孢桿菌。最近也有研究指出IS4Bsu1和IS256Bsu1是納豆芽孢桿菌特有的基因序列，可以根據(jù)IS4Bsu1和IS256Bsu1基因序列的有無鑒定納豆芽孢桿菌[30]。還有研究提出對16S rRNA和5 個其他功能基因（rpoB、purH、gyrA、groEL、polC）序列的多性進(jìn)行分析，可以作為確定納豆芽孢桿菌分類地位的一種方法[28]，Kubo等[24]根據(jù)該方法從日本稻草中篩選獲得能發(fā)酵黑大豆的納豆芽孢桿菌Miyagi-4100。

本研究篩選的納豆芽孢桿菌都具有產(chǎn)納豆激酶和發(fā)酵大豆生產(chǎn)納豆的能力，根據(jù)其大豆發(fā)酵產(chǎn)物中納豆激酶活性，來源于云南省騰沖市家庭自制豆豉的TC100和TC103菌株的納豆激酶活性最高，分別為550 U/mL和519 U/mL。而來源于河南省新鄉(xiāng)市家庭自制豆醬的HN48和云南省騰沖市家庭自制豆豉的TC100菌株，發(fā)酵大豆所得納豆的感官評價最高，評價分?jǐn)?shù)均是19 分。納豆激酶是一種微生物來源的蛋白酶，因具有纖維蛋白溶解活性而有別于其他蛋白酶，最初從傳統(tǒng)的日本大豆發(fā)酵食品納豆中被提取和純化[5]。1990年Sumi等[31]首先建立了標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白平板技術(shù)測定納豆的納豆激酶活性。目前已經(jīng)有很多關(guān)于芽孢桿菌屬微生物能產(chǎn)多種纖維蛋白溶解酶的報道。而在這些酶中納豆激酶因其在體內(nèi)體外均能發(fā)揮纖維蛋白溶解活性而被大眾廣泛關(guān)注[3,32]。近年來，納豆的保健功效受到越來越多研究人員及消費(fèi)者的重視，世界各國對其功能因子的研究方興未艾[33]。納豆的保健功效與其發(fā)酵菌株的產(chǎn)酶能力尤其是納豆激酶活性密切相關(guān)。同時作為食品，納豆的外觀、拉絲、氣味和口感也是影響其商品價值的重要因，其中γ-PGA產(chǎn)量越高，黏液就越多，拉絲效果和口感也就越好[34]。本研究篩選得到的8 株菌株中TC100菌株是高產(chǎn)納豆激酶的納豆芽孢桿菌，有望作為納豆生產(chǎn)的候選菌株。