李 強，韓亞昆，蔣 帥，張 悅，吳鶴云，徐慶陽，謝希賢

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300457）

反式-4-羥基-L-脯氨酸是一種稀有亞氨基酸[1]，主要以多肽形式存在于動物的膠原蛋白中[2]。反式-4-羥基-L-脯氨酸具有延緩衰老功效以及抗腫瘤、抗高血壓作用[3-4]，也被用于合成碳青霉烯類抗生和消炎藥等藥物[5-6]，因在醫(yī)藥保健、材料化工、食品營養(yǎng)和護膚美容等行業(yè)都具有廣泛應(yīng)用[7]。近年來，隨著反式-4-羥基-L-脯氨酸在醫(yī)藥和美容領(lǐng)域應(yīng)用的顯著增加，其市場需求量逐年增加，這對反式-4-羥基-L-脯氨酸的工業(yè)生產(chǎn)提出了更高的要求。

反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產(chǎn)方法主要包括蛋白質(zhì)水解法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法[8]。蛋白質(zhì)水解法和化學(xué)合成法工藝復(fù)雜、原料成本高，而微生物發(fā)酵法具有周期短、易控制、產(chǎn)率高和污染小等優(yōu)點，是大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的理想方法。20世紀(jì)60年代開始，國內(nèi)外很多科學(xué)家就開始對反式-4-羥基-L-脯氨酸生物合成開展研究，主要集中在L-脯氨酸-4-羥基化酶篩選和反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)生菌構(gòu)建方面。Baldwin等[9]首次從Streptomyces grixaviridru P8648分離得到L-脯氨酸-4-羥化酶，并確定了該酶的底物特異性。Shibasaki等[10]從指孢囊菌RH1中鑒定了L-脯氨酸-4-羥基化酶的基因，隨后將該基因克隆轉(zhuǎn)入大腸桿菌W1485，該重組菌在添加前體物L(fēng)-脯氨酸的條件下發(fā)酵100 h，反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到41 g/L，生產(chǎn)強度達(dá)到0.41 g/（Lg h）。后，Shibasaki等[11]進一步將密碼子優(yōu)化后的指孢囊菌的L-脯氨酸-4-羥基化酶基因引入L-脯氨酸生產(chǎn)菌中，以葡萄糖為底物發(fā)酵99 h，反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到25 g/L，生產(chǎn)強度達(dá)到 0.25 g/（Lg h），為直接發(fā)酵法生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸奠定了基礎(chǔ)。為構(gòu)建發(fā)酵性能更好的反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產(chǎn)菌株，F(xiàn)alcioni等[12]嘗試在谷氨酸棒狀桿菌來源的L-脯氨酸生產(chǎn)菌引入密碼子優(yōu)化后的指孢囊菌 L-脯氨酸-4-羥基化酶基因，發(fā)酵23 h，反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到7.1 g/L，生產(chǎn)強度達(dá)到0.31 g/（Lg h）。林凡[13]在Escherichia coli BL21（DE3）導(dǎo)入含密碼子優(yōu)化后的指孢囊菌的L-脯氨酸-4-羥基化酶基因，發(fā)酵64 h，反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到41.5 g/L，生產(chǎn)強度達(dá)到 0.65 g/（Lg h），這也是目前報道發(fā)酵水平最高的菌株。這些工程菌的構(gòu)建和改進推動了反式-4-羥基-L-脯氨酸的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)。

圖 1 大腸桿菌反式-4-羥基-L-脯氨酸合成代謝路徑Fig. 1 Biosynthetic pathway of trans-4-hydroxy-L-proline in E. coli

如前所述，雖然已有一些反式-4-羥基-L-脯氨酸工程菌的構(gòu)建研究，但現(xiàn)有菌株的生產(chǎn)效率仍然偏低，這也導(dǎo)致了反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產(chǎn)成本偏高。另外，由于這些菌株通過質(zhì)?？寺〉姆绞揭隠-脯氨酸-4-羥基化酶基因，一方面增加了菌體的負(fù)擔(dān)，另一方面會出現(xiàn)因質(zhì)粒丟失導(dǎo)致發(fā)酵不穩(wěn)定，這些也限制了菌種在規(guī)?；a(chǎn)中的應(yīng)用。針對這些問題，本研究從Micromonospora sp. CNB394篩選到一個高活性的L-脯氨酸-4-羥基化酶，并采用系統(tǒng)代謝工程技術(shù)通過阻斷L-脯氨酸的降解、解除L-脯氨酸反饋抑制、強化L-脯氨酸合成途徑，以及引入羥化反應(yīng)途徑，構(gòu)建高效率的反式-4-羥基-L-脯氨酸工程菌（圖1）。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所使用和構(gòu)建的菌株、質(zhì)粒見表1。

表 1 實驗所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑

Primer STAR HS DNA聚合酶 大連寶生物科技有限公司；2h Rapid Taq Mix、ClonExpress?II One Step Cloning Kit 南京諾唯贊生物科技有限公司；質(zhì)粒快速提取試劑盒、DNA凝膠純化回收試劑盒 美國Omega 公司；引物及基因均由蘇州金唯智科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

5 L發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備有限公司；S-433D氨基酸分析儀 北京捷盛依科科技有限公司；SBA-40C生物傳感儀 山東省科學(xué)院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 工程菌構(gòu)建

菌株構(gòu)建過程中，利用規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)-associated protein 9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9，CRISPRC a s 9）基因編輯方法進行基因的敲除和整合[14]。CRISPR-Cas9系統(tǒng)包括pGRB和pREDCas9兩個質(zhì)粒，其 中p R E D C a s 9 攜 帶g R N A 表 達(dá) 質(zhì) 粒p G R B 的消 除 系 統(tǒng)、λ 噬 菌 體 的R e d 重 組 系 統(tǒng)[15]及C a s 9 蛋白表達(dá)系統(tǒng)[16]，含奇霉抗性（工作質(zhì)量濃度 100 mg/L），32 ℃培養(yǎng)。pGRB以pUC18為骨架，包括啟動子J23100、gRNA-Cas9結(jié)合區(qū)域序列和終止子序列，含氨芐青霉抗性（工作質(zhì)量濃度100 mg/L），37 ℃培養(yǎng)。構(gòu)建質(zhì)粒pGRB的目的是轉(zhuǎn)錄相應(yīng)gRNA，從而與Cas9蛋白形成復(fù)合體，并通過堿基配對和PAM識別目的基因靶位點，實現(xiàn)目的DNA雙鏈斷裂。

1.3.1.1 gRNA質(zhì)粒和重組DNA片段構(gòu)建

為構(gòu)建gRNA質(zhì)粒，先設(shè)計合成兩條完全反向互補的單鏈DNA，然后通過退火形成雙鏈DNA，該雙鏈DNA中間序列是靶位點的特定gRNA間隔序列，兩端序列與pGRB具有同源序列。利用ClonExpress?II One Step Cloning Kit，雙鏈DNA與線性化pGRB通過同源重組形成gRNA表達(dá)質(zhì)粒。利用引物設(shè)計軟件primer5，以待敲除基因或待整合位點的上下游序列為模板，設(shè)計上下游同源臂引物（擴增長度約400～500）。以待整合基因為模板，設(shè)計整合基因的擴增引物，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增上下游同源臂和目的基因片段后，再經(jīng)過重疊PCR制備重組片段。

1.3.1.2 DNA片段重組

首先，將pREDCas9質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入E. coli W3110感受態(tài)細(xì)胞中[17]。通過菌落PCR篩選正確的陽性重組子，菌株接種于LB培養(yǎng)基32 ℃過夜培養(yǎng)，然后按1%的接種量轉(zhuǎn)移到100 mL 2h YT培養(yǎng)基中（1.6%蛋白胨、1%酵母浸粉、0.5% NaCl）。32 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞OD600nm達(dá)到0.1～0.2后，添加0.1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)重組酶表達(dá)。繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞OD600nm達(dá)到0.4～0.5，收集菌體制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞[18]。將200 ng重組DNA片段和100 ng gRNA質(zhì)粒加入感受態(tài)細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至0.1 cm電轉(zhuǎn)杯中，在1 850 kV條件下進行電轉(zhuǎn)化[19]。 電轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞加入1 mL SOC培養(yǎng)基中32 ℃復(fù)蘇2 h，然后取100～200 μL涂布到含氨芐和奇霉抗性的LB平板上。32 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落進行菌落PCR驗證，篩選陽性重組菌株。將陽性菌株在含有0.2%阿拉伯糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)pREDCas9中質(zhì)粒消除系統(tǒng)切割pGRB。最后將菌株在42 ℃培養(yǎng)過夜，消除溫敏性質(zhì)粒pREDCas9，獲得無質(zhì)粒的工程菌株。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵

1.3.3 發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵

發(fā)酵罐的培養(yǎng)基與搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基相同。利用無菌水將茄形瓶斜面菌種制成菌懸液，接入總裝液量為3 L的5 L發(fā)酵罐中。通過pH值電極控制自動流加氨水（體積分?jǐn)?shù)25%）維持pH 7.0左右；發(fā)酵過程溫度恒定在37 ℃；通過調(diào)節(jié)攪拌槳轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量控制溶氧在25%～35%之間。培養(yǎng)至細(xì)胞OD值達(dá)到12～16時，以15%接種量接入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵過程中控制pH 7.0左右，溫度維持在37 ℃，溶氧維持在25%～35%之間。當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗完之后，以一定的速率流加80%的葡萄糖溶液，維持發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量濃度在5 g/L以下[22]。

1.3.4 發(fā)酵過程中檢測與分析

大腸桿菌生物量利用紫外分光光度計在600 nm波長處的OD值檢測；發(fā)酵液中葡萄糖含量由SBA-40C生物傳感儀檢測；發(fā)酵液中谷氨酸、L-脯氨酸以及反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量采用S-433D氨基酸分析儀檢測；氨基酸含量采用茚三酮柱后衍生法利用S-433D氨基酸分析儀測定[23]。色柱分析條件：色柱LCA K06/Na，進量50 μL，檢測波長570 nm和440 nm，流動相流速 0.45 mL/min，反應(yīng)器溫度130℃。其中，L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸反應(yīng)后產(chǎn)物可在440 nm波長處被檢測到，其他氨基酸反應(yīng)后產(chǎn)物可在570 nm波長處被檢測到。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

發(fā)酵數(shù)據(jù)代表3 組平行發(fā)酵數(shù)據(jù)的f s。利用t檢驗雙尾分布對兩組發(fā)酵參數(shù)進行單向方差分析。P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 木糖誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)建立

在代謝工程研究中，對相關(guān)的內(nèi)源基因和異源基因進行過表達(dá)是常用的改造策略。T7啟動子是大腸桿菌中報道最強的啟動子，但是大腸桿菌自身沒有T7 RNA聚合酶，因首先需要在大腸桿菌中引入來源于T7噬菌體的RNA聚合酶[24]。另外，T7啟動子表達(dá)基因過強時，有時會影響菌體的生長，因需要控制T7 RNA聚合酶的表達(dá)時間及表達(dá)量。本研究首先利用CRISPR-Cas9基因編輯方法，以大腸桿菌W3110為出發(fā)菌，在lacZ位點整合了木糖啟動子控制的T7 RNA聚合酶基因，可實現(xiàn)在木糖誘導(dǎo)的條件下啟動T7 RNA聚合酶的表達(dá)[21]。隨后對dgsA（編碼糖代謝轉(zhuǎn)錄抑制因子）啟動子-10區(qū)進行點突變，解除了葡萄糖對木糖啟動子轉(zhuǎn)錄的阻遏作用[25]。最后對xlyA（木糖異構(gòu)酶）進行基因敲除，阻斷木糖的代謝途徑，減少木糖因分解代謝導(dǎo)致的損失[26]。通過以上基因操作，構(gòu)建的菌株HYP01可在木糖誘導(dǎo)的情況下實現(xiàn)相關(guān)基因的過表達(dá)。

2.2 強化L-脯氨酸合成途徑

2.2.1 L-脯氨酸操縱子過表達(dá)對L-脯氨酸合成的影響

γ-谷氨酸激酶為L-脯氨酸合成的限速酶，受到L-脯氨酸的反饋抑制。根據(jù)報道[27]，將編碼γ-谷氨酸激酶基因proB中319位G替換成A，編碼蛋白的第107位氨基酸天冬酰胺替換為L-脯氨酸，可解除L-脯氨酸的反饋抑制。啟動子是代謝工程中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要元件[28]，其中T7啟動子（PT7）和trc啟動子（Ptrc）是大腸桿菌中應(yīng)用最廣泛的兩種強啟動子[29]，但兩者轉(zhuǎn)錄強度不同。本研究首先敲除了菌株HYP01 L-脯氨酸脫氫酶基因putA，阻斷前體物L(fēng)-脯氨酸的降解途徑，構(gòu)建菌株HYP02（表1）。

為驗證PT7和Ptrc對L-脯氨酸操縱子的表達(dá)效果，在菌株HYP02的假基因位點yghX處整合proB*A，分別由PT7和Ptrc啟動轉(zhuǎn)錄，分別構(gòu)建了菌株HYP03和HYP04。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖2所示，HYP03的L-脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到5.5 g/L，HYP04的L-脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到11.8 g/L，是HYP03 L-脯氨酸產(chǎn)量的2.14 倍。圖2表明，采用Ptrc控制L-脯氨酸操縱子的過表達(dá)，效果更好。

圖 2 不同啟動子控制L-脯氨酸操縱子過量表達(dá)的發(fā)酵參數(shù)比較Fig. 2 Comparison of fermentation parameters for overexpression of proline operon controlled by different promoters

氨基酸分析結(jié)果還顯示，HYP03和HYP04的發(fā)酵液中都有少量L-谷氨酸積累（圖2），說明L-谷氨酸到L-脯氨酸的代謝通量仍需要加強。由于L-脯氨酸操縱子在Ptrc控制下效果更好，本研究在菌株HYP04的假基因位點trpR處整合第2個拷貝的Ptrc-proB*A，構(gòu)建了菌株HYP05。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖3所示，HYP05的L-脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到13.2 g/L，相比菌株HYP04（12.1 g/L）提高了9.1%，L-谷氨酸質(zhì)量濃度為0.4 g/L，比HYP04降低了77.8%，說明L-脯氨酸操縱子基因雙拷貝進一步增強了 L-脯氨酸的合成通量。

圖 3 雙拷貝proB*A對L-脯氨酸產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of double proB*A copy on proline production

2.2.2 增加胞內(nèi)NADPH供應(yīng)對L-脯氨酸合成的影響

NADPH是細(xì)胞內(nèi)重要的還原力，對于多種氨基酸的合成代謝都具有重要的作用[30]，氨基酸的生物合成往往因NADPH的供應(yīng)不足而受到限制。如圖1所示，合成1 mol的L-脯氨酸需要3 mol NADPH，NADPH的供應(yīng)也是L-脯氨酸合成的限制性因。大腸桿菌的基因pntAB編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶PntAB，可以催化NADP(H)與NAD(H)之間氫負(fù)離子可逆轉(zhuǎn)移，增強PntAB的表達(dá)被證明能夠有效提高大腸桿菌胞內(nèi)NADPH的供應(yīng)[31]。由于PntAB是膜蛋白，表達(dá)量過大有時也會對菌體生長造成負(fù)面影響。本研究在HYP05的假基因yeeP位點處整合了自身啟動子控制的pntAB基因，構(gòu)建了菌株HYP06。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖4所示，HYP06的L-脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到15.3 g/L，相比HYP05（13.1 g/L）提高了16.8%，說明增加NADPH的供應(yīng)顯著提高L-脯氨酸的積累。

圖 4 增強NADPH供應(yīng)對L-脯氨酸產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effect of enhancing NADHP supply on proline production

2.3 高活性L-脯氨酸-4-羥基化酶的篩選

大腸桿菌中不存在L-脯氨酸-4-羥基化酶基因，反式-4-羥基-L-脯氨酸合成途徑的重構(gòu)需要引入外源的 L-脯氨酸-4-羥基化酶基因，因高活性的L-脯氨酸-4-羥基化酶是反式-4-羥基-L-脯氨酸工程菌構(gòu)建的關(guān)鍵。根據(jù)指孢囊菌RH1的L-脯氨酸-4-羥基化酶的氨基酸序列（GenBank：BAA20094.1），在NCBI數(shù)據(jù)庫通過BLAST比對，挑選了與L-脯氨酸-4-羥基化酶具有保守催化結(jié)構(gòu)域的4 個基因（分別命名為p4H1、p4H2、p4H3和p4H4），分別來源于Micromonospora sp. CNB394、Nocardia sp. BMG111209、Kutzneria albida DSM 43870、Streptomyces sp. SA15。將密碼子優(yōu)化后的p4h、p4H1、p4H2、p4H3和p4H4連接到pTrc99a，導(dǎo)入菌株HYP06中，構(gòu)建了菌株HYP07、HYP08、HYP09、HYP10和HYP11。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖5所示，HYP07、HYP08、HYP09和HYP10發(fā)酵液中反式-4-羥基-L-脯氨酸質(zhì)量濃度分別為8.6、9.5、7.6 g/L和2.3 g/L，表明p4H1、p4H2、p4H3具有L-脯氨酸-4-羥基化酶的活性。來源于Micromonospora sp. CNB394的p4H1活性最高，與菌株HYP07相比，HYP08的反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量提高了10.5%。

圖 5 含L-脯氨酸-4-羥基化酶的菌株發(fā)酵參數(shù)比較Fig. 5 Comparison of fermentation parameters for recombinant strains with different L-proline-4-hydroxylases

2.4 L-脯氨酸-4-羥基化酶過表達(dá)對反式-4-羥基-L-脯氨酸合成的影響

為驗證p4H1在基因組上的表達(dá)活性，將p4H1整合于菌株HYP06的假基因位點tehB處，分別由PT7和Ptrc啟動轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建了菌株HYP12和HYP13。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖6所示，HYP12的反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到4.9 g/L，比菌株HYP13（3.2 g/L）高53.1%；說明p4H1在PT7控制下的表達(dá)效果更好。

圖 6 不同啟動子控制p4H1過量表達(dá)的發(fā)酵參數(shù)比較Fig. 6 Comparison of fermentation parameters for overexpression of p4H1 controlled by different promoters

從圖6可知，HYP12和HYP13的發(fā)酵液中均有前體物L(fēng)-脯氨酸殘留，說明L-脯氨酸-4-羥基化酶的表達(dá)量不足。為進一步提高反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量，在HYP12假基因ycjV處整合第2個拷貝的PT7-p4H1，構(gòu)建了菌株HYP14。如圖7所示，HYP14的反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到11.7 g/L，相比HYP12（5.0 g/L）提高了 1.34 倍，L-脯氨酸質(zhì)量濃度降低到3.5 g/L。隨后在HYP14的假基因yjiP位點進行整合了第3個拷貝的PT7-p4H1，構(gòu)建了菌株HYP15。反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到13.6 g/L，相比HYP14提高了16.2%，L-脯氨酸質(zhì)量濃度降低到1.5 g/L。

圖 7 p4H1拷貝數(shù)對發(fā)酵參數(shù)的影響Fig. 7 Effect of p4H1 copy number on fermentation parameters

2.5 工程菌發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵

為評估菌株HYP15的生產(chǎn)性能，在5 L發(fā)酵罐中進行分批補料發(fā)酵實驗。如圖8所示，隨著發(fā)酵時間延長，細(xì)胞生物量逐步增加，最終OD600nm達(dá)到了70。12～36 h，反式-4-羥基-L-脯氨酸保持了較高的合成速率，40 h的產(chǎn)量達(dá)到48.6 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率（最終合成反式-4-羥基-L-脯氨酸總量與上發(fā)酵消耗總糖量之比）和生產(chǎn)強度分別達(dá)到了21.6%和1.22 g/（Lg h）。發(fā)酵液中可檢測到的副產(chǎn)物有L-脯氨酸和乙酸，質(zhì)量濃度分別為2.3 g/L和0.9 g/L。

圖 8 工程菌HYP15在5 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵曲線Fig. 8 Fed-batch fermentation profiles of the engineered strain HYP15 in a 5-L bioreactor

3 結(jié) 論

本研究構(gòu)建了1 株無質(zhì)粒、從頭高效合成反式-4-羥基-L-脯氨酸的大腸桿菌基因工程菌。工程菌的構(gòu)建過程包括：1）通過引入木糖啟動子控制的T7 RNA聚合酶基因，在大腸桿菌W3110中建立木糖誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)；2）通過刪除L-脯氨酸脫氫酶基因putA，阻斷L-脯氨酸的降解途徑；3）通過L-脯氨酸操縱子和吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因整合，增強了L-脯氨酸的合成代謝；4）篩選到高活性的L-脯氨酸-4-羥基化酶基因p4H1；5）通過L-脯氨酸-4-羥基化酶基因整合，強化反式-4-羥基-L-脯氨酸的合成代謝。以葡萄糖為碳源進行分批補料發(fā)酵40 h，工程菌HYP15的反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到48.6 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度分別達(dá)到了21.6%和1.22 g/（Lg h）。

與現(xiàn)有報道的反式-4-羥基-L-脯氨酸生產(chǎn)菌相比，該工程菌，具有以下優(yōu)勢：1）菌株基因型明確，遺傳穩(wěn)定性好；2）不含質(zhì)粒表達(dá)載體，避免抗生的使用；3）發(fā)酵周期短，生產(chǎn)強度高。工程菌具有良好的工業(yè)化前景，為反式-4-羥基-L-脯氨酸發(fā)酵法生產(chǎn)提供了理論支持。