向慧平，林宜錦，關(guān)統(tǒng)偉,，張家旭，尚紅光，趙小林，焦士蓉，馮 栩，楊 陽

（1.西華大學(xué)微生物研究所，四川省高校食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039；2.成都蜀之源酒業(yè)有限公司，四川 成都 611335）

中國白酒獨(dú)特的固態(tài)發(fā)酵技術(shù)已有數(shù)千年的歷史[1-2]， 而濃香型白酒以其香味諧調(diào)濃郁和口感綿甜醇厚的優(yōu)良品質(zhì)，占據(jù)了70%的中國白酒市場。曲為酒之骨，濃香型大曲是釀造優(yōu)質(zhì)濃香型白酒的關(guān)鍵，它屬于中高溫曲，55～60 ℃的頂溫[3]。常見的制曲工藝分為1 個月的曲房培菌期和3 個月的貯存期[4]。而在實(shí)際生產(chǎn)中，大曲的貯存期往往會被延長，部分大曲的貯存期甚至?xí)谎娱L至1 年以上。目前，國內(nèi)學(xué)者對大曲的研究已經(jīng)由表及里深入到大曲的特征風(fēng)味[5]、微生物類群演替及其功能表達(dá)[6-7]，并取得了許多成果，研究發(fā)現(xiàn)棲息于大曲中的微生物決定了大曲的品質(zhì)，它們不僅參與白酒的發(fā)酵，還提供豐富的酶系（如糖化酶、纖維酶、淀粉酶和酯酶等）用于底物降解和風(fēng)味化合物的生產(chǎn)，同時(shí)制曲過程中產(chǎn)生的代謝物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為末端風(fēng)味成分的中間體。

大曲中微生物菌系時(shí)刻在進(jìn)行復(fù)雜的動態(tài)變化，其中豐度最高的微生物類群是霉菌，其次為酵母和細(xì)菌[8]。霉菌為大曲提供了主要的糖化動力，然而其多性遠(yuǎn)低于酵母和細(xì)菌[9-11]。因，研究者對大曲霉菌類群投入了更多的關(guān)注，霉菌在大曲中起到的作用和影響逐漸被剖析，其中曲霉主要為曲酒的釀造提供糖化力、液化力、蛋白質(zhì)分解能力及多種有機(jī)酸等物質(zhì)[2]，以米根霉為主的根霉可產(chǎn)生較多的胞外酶和胞內(nèi)酶[12]，毛霉生成的分解蛋白質(zhì)酶系對曲酒發(fā)酵至關(guān)重要[2,13]，而青霉、犁頭霉基本屬于有害菌[2]。雖然酵母菌為大曲提供了主要的發(fā)酵動力，細(xì)菌為大曲提供了主要的生香動力[9]，但是與霉菌相比，目前對大曲酵母和細(xì)菌類群的研究仍然不夠深入。

酵母作為大曲微生物區(qū)系中最重要的類群之一，不僅主導(dǎo)了乙醇的產(chǎn)生，而且大量產(chǎn)生酯類、醇類、酮類、烯類、酚類等揮發(fā)性化合物[14-15]，對大曲品質(zhì)有決定性的影響。譚崇堯等[16]使用高通量測序法對不同地域濃香型大曲的微生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明川派濃香型大曲中芽孢桿菌屬的豐度遠(yuǎn)高于其他地區(qū)。另外，一些研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌不僅能夠產(chǎn)生大量揮發(fā)性化合物和有機(jī)酸影響大曲的微生物菌系和風(fēng)味[17-18]，而且還具有顯著改善中國白酒的品質(zhì)、安全性和風(fēng)味的潛力[19-20]。因，本研究通過純培養(yǎng)分離技術(shù)監(jiān)測四川濃香型大曲整個制曲過程中酵母菌、芽孢桿菌的動態(tài)演化以及相應(yīng)的動態(tài)工藝指標(biāo)，科學(xué)分析它們之間的關(guān)聯(lián)特性，為優(yōu)質(zhì)大曲的釀造和大曲自動化制備及其改良提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，明確大曲的成熟期與品質(zhì)下降期，從而更好地指導(dǎo)釀酒生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP和DL2000 Marker 寶生物工程（大連）有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；實(shí)驗(yàn)涉及的所有緩沖液與常備試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，購于成都迪維普科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

P C R 儀、電泳儀及凝膠成像分析系統(tǒng) 美國 Bio-Rad公司；離心機(jī) 德國Eppendorf公司；恒溫培養(yǎng)箱、SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；搖床、超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌和芽孢桿菌的分離

準(zhǔn)確稱取不同階段的大曲粉末1 g，加入100 mL無菌水，置于搖床上150 r/min、30 min，靜置，取其上清液進(jìn)行系列10 倍梯度稀釋。首先采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose agar，YEPD）培養(yǎng)基對酵母菌進(jìn)行選擇性分離，形態(tài)觀察用Wallerstein Laboratory（WL）培養(yǎng)基。其次是芽孢桿菌的分離，將不同濃度的稀釋液分別接種到富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集（37 ℃、 150 r/min培養(yǎng)24 h），隨后對培養(yǎng)液進(jìn)行菌體殺滅和富集芽孢（90 ℃，5 min），在LB培養(yǎng)基、乙酸鈉培養(yǎng)基和蘇氨酸液體發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行平板分離。

1.3.2 菌株的初步鑒定

將分離的所有菌株經(jīng)過初步形態(tài)聚類，選取代表菌株用十六烷基三甲基溴化銨法提取菌株DNA[21-22]，采用通用保守引物ITS1和ITS4對酵母菌株的5.8S rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行基因擴(kuò)增，采用通用保守引物27f和1541r擴(kuò)增芽孢桿菌的16S rRNA基因片段。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（Sangon）純化并測序，將所測得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，結(jié)合形態(tài)學(xué)分析和序列比對對菌株進(jìn)行排重和初步鑒定。

1.3.3 工藝指標(biāo)檢測

使用溫度計(jì)測量曲堆中心溫度；制曲理化因子（水分、酸度、淀粉含量）和大曲質(zhì)量指標(biāo)（糖化力、液化力、發(fā)酵力、酯化力）的測定按照QB/T 4257ü 2011《釀酒大曲通用分析方法》[23]進(jìn)行。

1.3.4 相關(guān)性分析

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)酵母菌和芽孢桿菌的分離與動態(tài)變化

表 1 11 個樣品中酵母菌和芽孢桿菌典型菌株的分離情況統(tǒng)計(jì)Table 1 Typical species of the culturable yeast and Bacillus detected in 11 samples

2.2 大曲理化指標(biāo)變化

表 2 濃香型大曲發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的動態(tài)變化Table 2 Dynamic changes in physicochemical indexes during the fermentation of Luzhou-flavor Daqu

濃香型大曲生產(chǎn)過程中最重要的控制條件是堆芯溫度、水分和酸度，實(shí)際生產(chǎn)中通常用這3 個條件控制曲房培菌期的生產(chǎn)狀況；外，淀粉也揭示了大曲生產(chǎn)過程中主要的能量代謝情況。如表2所示，曲塊堆芯溫度在培菌期前3 d快速增加至49 ℃，并在第9天升到最高溫度60 ℃，達(dá)到中高溫大曲的頂溫范圍，隨后堆芯溫度緩慢降低，直至第15天仍有55 ℃。水分是大曲生產(chǎn)過程中另一個關(guān)鍵點(diǎn)，在培菌期前15 d快速降低至16.27%，損失了17.55%的水分，而在之后的15 d損失了3.01%的水分，培菌期結(jié)束時(shí)僅為13.26%；在貯存期水分略有降低，但是變化不顯著。大曲的酸度在培菌期前3 d由0.16 mmol/10 g快速增加至1.77 mmol/10 g，酸度升高主要是由產(chǎn)酸微生物在大曲中進(jìn)行有機(jī)酸代謝，酸度在第15天快速下降至0.96 mmol/10 g；而在培菌期穩(wěn)定在1 mmol/10 g左右。淀粉作為最主要的碳源，其變化趨勢直接表征了大曲生產(chǎn)過程中微生物的能量代謝狀況。11.39%的淀粉在發(fā)酵前15 d被利用，2.70%的淀粉在發(fā)酵后15 d被利用，而整個貯存期則有9.10%的淀粉被利用。

2.3 大曲質(zhì)量指標(biāo)的變化

白酒釀造過程通常用糖化力和液化力衡量大曲的淀粉轉(zhuǎn)化能力，用發(fā)酵力和酯化力作為評估大曲產(chǎn)酒產(chǎn)香能力的關(guān)鍵指標(biāo)。液化力與糖化力變化趨勢大致一致（圖1），都在培菌前期快速增加后小幅下降，接著在培菌中后期又逐漸回升，而在貯存期總體上呈下降趨勢。液化力在第9天達(dá)到最大值2.17 g/（gg h），第9～15天逐漸下降至1.09 g/（g?h），在培菌中后期又逐漸上升至1.27 g/（g?h），而在貯存期，液化力一直下降，結(jié)束時(shí)僅剩0.72 g/（g?h）。糖化力在前9 d快速增加至447.22 mg/（gg h），接著緩慢下降至 425.76 mg/（gg h）（第15天），隨后緩慢增加至貯存期第180天的477.61 mg/（gg h），而在貯存期的第181～360天，大曲損失了180.84 mg/（gg h）的糖化力。發(fā)酵力反映了大曲發(fā)酵產(chǎn)乙醇的能力，酯化力反映了大曲微生物生產(chǎn)酯類物質(zhì)的能力，如圖2所示，培菌期前9 d酯化力和發(fā)酵力快速升高，培菌期第0天品的酯化力和發(fā)酵力分別為31.52 mg/（50 gg 7 d）和 0.2 8 g/（0.5 g g 7 2 h），第9 天分別升高至 738.58 mg/（50 gg 7 d）和1.02 g/（0.5 gg 72 h）。隨后酯化力持續(xù)增加，在貯存期第9 0 天時(shí)高達(dá) 944.57 mg/（50 gg 7 d），而在貯存期的第181～360天，酯化力快速下降至475.66 mg/（50 gg 7 d）。不同的是，發(fā)酵力在培菌期第9～15天快速下降后又緩慢回升，培菌期結(jié)束時(shí)逐漸穩(wěn)定在1.13 g/（0.5 gg 72 h），發(fā)酵力在貯存期呈緩慢降低的趨勢，貯存期結(jié)束時(shí)為 0.69 g/（0.5 gg 72 h）。同在整個貯存期的第90～180天，4 個質(zhì)量指標(biāo)都趨于穩(wěn)定并處于較高水平，而在貯存期的第180～360天卻大幅下降，綜合考慮，本研究所用大曲在生產(chǎn)周期第90天后品質(zhì)達(dá)到穩(wěn)定成熟；生產(chǎn)周期第90～180天為大曲最佳使用期。

圖 1 濃香型大曲生產(chǎn)過程中糖化力、液化力的動態(tài)變化Fig. 1 Dynamic changes in saccharifying power and liquefying power during the fermentation of Luzhou-flavor Daqu

圖 2 濃香型大曲生產(chǎn)過程中酯化力、發(fā)酵力的動態(tài)變化Fig. 2 Dynamic changes in esterifying power and fermenting power during the fermentation of Luzhou-flavor Daqu

2.4 濃香型大曲生產(chǎn)中工藝指標(biāo)與酵母菌和芽孢桿菌類群的關(guān)聯(lián)性分析

制曲工藝通過溫度、水分和酸度的調(diào)控，篩選和富集了大量有益微生物。微生物的演替和代謝最大化積累了各種功能酶和風(fēng)味物質(zhì)，同時(shí)通過曲房貯存平衡微生物菌系提高大曲品質(zhì)。因，了解大曲中起主要作用的酵母菌和芽孢桿菌與關(guān)鍵指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性極其重要。RDA（圖3）展示，堆芯溫度、水分和淀粉含量與多種微生物類群負(fù)相關(guān)，其中與B. velezensis、 C. parapsilosis、J. angkorensis、K. marxianus和 S. cerevisiae呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。酸度與B. siamensis、B. licheniformis和B. cereus顯著正相關(guān) （P＜0.05），表明這3 株芽孢桿菌可能具有良好的產(chǎn)酸或耐酸能力。4 個質(zhì)量指標(biāo)之間本身具有較強(qiáng)的正相關(guān)，其中B. horneckiae和B. subtilis與液化力具有顯著的正相關(guān)（P＜0.05）；K. exigua和C. tropicalis與酯化力、糖化力具有顯著的正相關(guān)（P＜0.05）； W. anomalus和B. megaterium與發(fā)酵力具有顯著的正相關(guān)（P＜0.05），表明這6 株菌是潛在的功能菌，對大曲的品質(zhì)起著重要影響。

圖 3 大曲生產(chǎn)中工藝指標(biāo)與酵母菌和芽孢桿菌類群的關(guān)聯(lián)性分析Fig. 3 Correlation analysis of the communities of yeast and Bacillus with process parameters during the fermentation of Luzhou-flavor Daqu

3 討 論

目前，對于濃香型大曲的工藝參數(shù)[25]、微生物菌系演替及其功能作用[26-27]等已經(jīng)有一些研究，但是學(xué)者們往往聚焦于曲房培菌期，而對于濃香型大曲成熟期、貯存期的微生物、酶學(xué)及其工藝參數(shù)指標(biāo)研究的相對較少，且不系統(tǒng)。本研究旨在多度系統(tǒng)分析四川濃香型大曲整個生產(chǎn)周期中酵母菌和芽孢桿菌多性變化，并結(jié)合理化指標(biāo)和質(zhì)量指標(biāo)，探索濃香型大曲關(guān)鍵性微生物類群中的酵母菌和芽孢桿菌在大曲品質(zhì)形成中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)四川濃香型大曲在第90～180天期間品質(zhì)穩(wěn)定成熟，是釀酒最好的使用期。成熟后的大曲糖化力、液化力、酯化力和發(fā)酵力都達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，其中第90天時(shí)發(fā)酵力高達(dá)1.15 g/（0.5 g?72 h），而宋瑞濱等[28]研究的優(yōu)質(zhì)中高溫大曲的發(fā)酵力僅為0.58 g/（g?72 h）；同時(shí)酯化力在第90天時(shí)最高為944.57 mg/（50 g?7 d），也遠(yuǎn)超行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的最低酯化力150 mg/（50 g?7 d）。大曲在第180天后質(zhì)量開始劇烈下降，其中糖化力與酯化力下降幅度最大；如果以第90天為優(yōu)質(zhì)大曲，那么貯存期結(jié)束時(shí)已經(jīng)損失了相當(dāng)于優(yōu)質(zhì)大曲36.89%的糖化力和49.64%的酯化力。因，貯存6 個月后的大曲由于品質(zhì)的下降，應(yīng)加強(qiáng)貯存方法的改進(jìn)，延長其高品質(zhì)期；同時(shí)，在未來釀酒過程中應(yīng)加強(qiáng)與新成熟大曲的混用，彌補(bǔ)其不足。當(dāng)然，由于貯存條件、制曲工藝和區(qū)域生態(tài)環(huán)境的差異，應(yīng)實(shí)時(shí)檢測大曲質(zhì)量，更好地指導(dǎo)釀酒生產(chǎn)。

本研究表明四川濃香型大曲具有豐富的可培養(yǎng)酵母菌和芽孢桿菌多性，共分離到9 個屬的酵母菌以及8 個種的芽孢桿菌。與以往研究相比[26-27]，首次在濃香型大曲中分得J. angkorensis和B. velezensis。外，Yang Jiangang等[29]同對濃香型大曲生產(chǎn)過程中的微生物類群進(jìn)行選擇性分離，發(fā)現(xiàn)成曲中細(xì)菌以枯草芽孢桿菌亞種為優(yōu)勢菌，酵母類群以扣囊復(fù)膜孢酵母（S. fibuligera）為優(yōu)勢菌。在本研究中枯草芽孢桿菌同為優(yōu)勢菌，而扣囊復(fù)膜孢酵母并未分離得到，我國白酒制曲是開放式自然制曲，存在大曲的品質(zhì)與微生物群落的不穩(wěn)定性，進(jìn)而影響白酒的品質(zhì)與穩(wěn)定性。

RDA結(jié)合工藝指標(biāo)對大曲酵母菌和芽孢桿菌類群類群演化進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)了6 種關(guān)鍵微生物類群，分別是3 種酵母菌（K. exigua、C. tropicalis和 W. anomalus）和3 種芽孢桿菌（B. horneckiae、B. subtilis和B. megaterium），它們分別與4 個質(zhì)量指標(biāo)顯著正相關(guān)，這將為未來開發(fā)純種制曲提供科學(xué)依據(jù)。外， B. cereus、B. licheniformis和B. siamensis與酸度顯著相關(guān)，有研究表明B. cereus和B. licheniformis是白酒生產(chǎn)中的重要產(chǎn)酸菌[17-18]，則大曲生產(chǎn)過程中嚴(yán)格控制酸度有助于調(diào)控和平衡大曲中的微生物組成與數(shù)量，同時(shí)產(chǎn)生的有機(jī)酸還將與醇類化合物反應(yīng)產(chǎn)生濃郁的白酒風(fēng)味化合物[30-32]。關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)4 個質(zhì)量指標(biāo)與堆芯溫度都沒有顯著相關(guān)關(guān)系，而Xiao Chen等[33]研究發(fā)現(xiàn)以堆芯溫度為代表的生物熱是影響中高溫大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子，則制曲過程中溫度對大曲品質(zhì)調(diào)控可能更多的是間接作用，因在濃香型大曲生產(chǎn)工藝優(yōu)化時(shí)應(yīng)更全面了解這種間接作用。

本研究在分析大曲生產(chǎn)過程中酵母菌和芽孢桿菌類群演替的基礎(chǔ)上，結(jié)合工藝指標(biāo)檢測，揭示了大曲生產(chǎn)過程中酵母菌和芽孢桿菌類群受理化因子的調(diào)控作用以及對大曲品質(zhì)的影響，這將為大曲生產(chǎn)工藝中控溫、控水、排酸，優(yōu)質(zhì)大曲的釀造和大曲自動化制備與改良提供很好的科學(xué)參考。然而大曲微生物類群是一個完整的共生體，酵母菌和芽孢桿菌發(fā)揮作用離不開其他微生物的存在。本研究直接將酵母菌和芽孢桿菌從大曲微生物菌系中剝離出來，不考慮與其他微生物類群的相互作用，如霉菌、醋酸菌、乳酸菌和放線菌等，是對大曲微生物類群調(diào)控和功能作用的淺層研究。采用更全面的微生物多性分析技術(shù)，研究大曲生產(chǎn)過程中微生物類群受理化因子的調(diào)控作用以及對大曲品質(zhì)的影響，將是未來更好地理解大曲發(fā)酵原理的新思路。