李秀明，劉靜靜，閆利娟，楊 華，王 洋，馬儷珍,

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；2.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384；3.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384）

N-亞硝胺具有致癌、致畸、致突變性，對人體健康有極大危害。它主要由氮氧化物和仲胺反應(yīng)生成，含有大量前體物，如含亞硝酸鹽和胺類物質(zhì)的食品極易生成N-亞硝胺，且pH值、溫度等均是影響其生成的重要 因[1]。在腌肉制品加工中，為了同時起到發(fā)色、抑菌、抗氧化、提高風(fēng)味的作用[2]，按照國家標(biāo)準(zhǔn)，亞硝酸鹽的最大添加量為0.15 g/kg[3]，在加工、貯藏過程中，肉中蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物[4]可為N-亞硝胺的生成提供前體物，加熱溫度和時間的影響亦極大地促進(jìn)N-亞硝胺的生成[5]，所以腌肉制品中會有N-亞硝胺形成的潛在危險。因如何降低產(chǎn)品中N-亞硝胺的含量對于食品安全控制方面具有重要的意義。

乳酸菌在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中應(yīng)用廣泛（如酸奶、酸菜、發(fā)酵香腸等），有提高產(chǎn)品風(fēng)味和營養(yǎng)的作用[6]。目前學(xué)者利用乳酸菌抑制N-亞硝胺多針對發(fā)酵食品，如在食品制作時接種活菌發(fā)酵，作用于N-亞硝胺前體物，降解亞硝酸鹽[7-9]和抑制胺類物質(zhì)形成[10-11]；也有學(xué)者從一些產(chǎn)品中分離篩選出能夠降解亞硝酸鹽[12-14]和生物胺[15]的乳酸菌研究其作用機(jī)理，結(jié)果表明為酸度、亞硝酸鹽還原酶、生物胺氧化酶的作用，或降低在食品加工過程中生成N-亞硝胺，這可能是乳酸菌產(chǎn)酸降低pH值抑制腐敗菌生長，從而間接抑制了易生成N-亞硝胺的物質(zhì)形成[16-17]，也有學(xué)者提出是由于微生物對N-亞硝胺具有吸附或降解的作用[18]；肖亞慶等[19]研究發(fā)現(xiàn)戊糖乳桿菌中位于細(xì)胞壁最外層的表層蛋白具有降解N-甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）和N-乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）的效果，也可能是由于乳酸菌分泌了可降解N-亞硝胺的酶[20]。但以上研究多為在發(fā)酵溫度（如37 ℃）下探究乳酸菌對N-亞硝胺的降解機(jī)理，對于無發(fā)酵工藝的產(chǎn)品加工中則不太適用，如紅腸等。

經(jīng)前期研究（數(shù)據(jù)未發(fā)表），將腌制好的肉餡在真空攪拌機(jī)中加入輔料的同時接種PRO-MIX5乳酸菌發(fā)酵劑（木糖葡萄球菌清酒乳桿菌類植物乳桿菌），灌裝后首先經(jīng)過12 h的發(fā)酵過程，再按照紅腸的加工工藝進(jìn)行干燥、蒸煮、烘、煙熏等，實驗結(jié)果表明接種某些乳酸菌發(fā)酵后確實能夠減少紅腸中N-亞硝胺的形成，降低亞硝酸鹽的殘留量，提高產(chǎn)品的安全性，但發(fā)酵會延長產(chǎn)品的加工周期，對加工設(shè)備和環(huán)境衛(wèi)生要求更高，且經(jīng)發(fā)酵后紅腸產(chǎn)品有微酸味，消費(fèi)者不易接受。針對以上問題，本研究提出假設(shè)，能否在體外培養(yǎng)這種特殊乳酸菌菌株，探究其抑制N-亞硝胺形成的機(jī)理，提取其中有效抑制N-亞硝胺的物質(zhì)，然后直接添加到類似紅腸、培根等沒有發(fā)酵環(huán)節(jié)的肉制品中，不經(jīng)過發(fā)酵即可降低產(chǎn)品中N-亞硝胺含量，提高其食用安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬肉 天津市康寧肉制品有限公司；PRO-MIX5 意大利薩科公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 方法

豬瘦肉與水以1∶2比例勻漿，經(jīng)4 次沸水浴加熱10 min、勻漿后于121 ℃高壓滅菌20 min，在所得液體中加入4%葡萄糖，得到肉培養(yǎng)基，用于初步探索過程中培養(yǎng)PRO-MIX5乳酸菌使用。

1.3.2 PRO-MIX5乳酸菌培養(yǎng)物處理方式

PRO-MIX5乳酸菌培養(yǎng)物4 ℃、5 000h g離心15 min，棄掉上清液得到菌體；用25 mmol/L、pH 6的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）4 ℃、5 000h g離心15 min，沖洗菌體2 次；添加終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶菌酶在30 ℃作用2 h，再用超聲波細(xì)胞破碎儀以200 W的功率，超聲2 s、停2 s共進(jìn)行5 min[21]。上述溶液在4 ℃、10 000h g離心10 min。

1.3.3 NDMA模擬體系制備

參考Kuniyuki等[22]的方法，并稍作修改，使反應(yīng)體系中NaNO2和DMAg HCl終濃度分別為20 mmol/L和10 mmol/L，且以上試劑均用濃度為25 mmoL/L、pH 6的PBS配制，將該體系于80 ℃水浴鍋中反應(yīng)1 h后，加入6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至13終止亞硝化反應(yīng)，置于冰浴中迅速冷卻后加入5 mL氯甲烷，充分振蕩1 min，使氯甲烷與品充分混勻，在4 ℃、10 000h g離心5 min，吸取底部氯甲烷層的清亮部分過0.45 μm濾膜后轉(zhuǎn)入氣相色儀的小瓶中待上機(jī)。

1.3.4 實驗設(shè)計

圖 1 實驗設(shè)計方案Fig. 1 Schematic illustration for the experimental design

為了分析PRO-MIX5乳酸菌培養(yǎng)物對N-亞硝胺的抑制機(jī)理，分別在降解亞硝酸鹽和抑制NDMA形成兩個方面進(jìn)行逐步篩選，實驗設(shè)計總體方案見圖1所示。

1.3.4.1 發(fā)酵代謝產(chǎn)物對亞硝酸鹽的降解作用

由于PRO-MIX5是在紅腸中應(yīng)用篩選得到能夠抑制 N-亞硝胺形成的優(yōu)勢乳酸菌發(fā)酵劑，且在發(fā)酵第12小時效果最佳，為盡量保持在體外制作時所得產(chǎn)物一致，實驗以PRO-MIX5商業(yè)發(fā)酵劑為研究對象，接種在1.3.1節(jié)制得的液態(tài)肉培養(yǎng)基中，發(fā)酵12 h（35 ℃）得到混合發(fā)酵液，經(jīng)4 ℃、5 000h g離心15 min獲得發(fā)酵上清液，即為該商業(yè)發(fā)酵劑的代謝產(chǎn)物。為了解這種混合發(fā)酵液和發(fā)酵上清液的作用濃度、作用溫度和作用時間是否可以清除模擬體系中的亞硝酸鹽，設(shè)計了2 個實驗。

實驗方案1的作用溫度模擬肉的腌制溫度，設(shè)定為4 ℃，在50 mL離心管中分別加入混合發(fā)酵液和發(fā)酵上清液1.5、3、6 mL，以終質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL加入NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加蒸餾水至30 mL，混合發(fā)酵液和發(fā)酵上清液的作用時間均為0、8、16 h，在規(guī)定時間立即測定體系中的亞硝酸鹽含量。

實驗方案2中，為進(jìn)一步驗證發(fā)酵上清液，即代謝產(chǎn)物的作用，將發(fā)酵上清液的添加濃度提高，取20 mL發(fā)酵上清液于50 mL離心管中，以終質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL加入NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加蒸餾水至30 mL，分別置于4 ℃（模擬腌制溫度）和35 ℃（模擬發(fā)酵溫度）環(huán)境中作用，在作用的第0、8、21、32小時立即取測定體系中的亞硝酸鹽含量。

1.3.4.2 乳酸菌胞內(nèi)酶釋放后對亞硝酸鹽的降解作用

按照表1的前處理方式得到4 組混合液，對菌體進(jìn)行溶菌酶作用和細(xì)胞破碎處理，使其釋放出胞內(nèi)酶后所得液體分別為混合發(fā)酵液、沉淀與水混合物、沉淀與PBS混合物、乳酸組發(fā)酵液，各取20 mL于50 mL離心管中，以終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL加入NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加蒸餾水至30 mL，置于30 ℃反應(yīng)，分別測定第0、1、2小時反應(yīng)體系中亞硝酸鹽的殘留量。

表 1 PRO-MIX5發(fā)酵劑降解亞硝酸鹽混合液的實驗方案Table 1 Preparation of nitrite inhibitors from the fermentation broth of PRO-MIX5

1.3.4.3 混合發(fā)酵液和沉淀與水混合物對NDMA形成的影響

在生成NDMA的模擬體系中加入混合發(fā)酵液和沉淀與水混合物各5 mL于總體積為20 mL的NDMA模擬體系中，30 ℃保溫反應(yīng)2 h后，80 ℃加熱1 h，空白對照組（CK組）則直接加熱反應(yīng)，測定NDMA的生成量。

1.3.4.4 不同處理方式的菌體對NDMA形成的影響

將在添加10 μg/mL NaNO2的MRS培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)的PRO-MIX5菌體分別以活菌（離心MRS培養(yǎng)基得到菌體，用PBS沖洗菌體2 次）和死菌（將沖洗后的菌體于100 ℃水浴加熱15 min）的狀態(tài)，以濕質(zhì)量的0.1 g加入20 mL形成NDMA的模擬體系中，且篩選不同的作用方式：加入模擬體系后直接80 ℃加熱反應(yīng)1 h；在30 ℃保溫作用2 h后，再80 ℃加熱反應(yīng)1 h，同時做空白對照。

1.3.4.5 菌體不同組分對NDMA形成的影響

用MRS肉湯培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)PRO-MIX5后離心得到菌體，用PBS沖洗菌體兩次后，用菌體與PBS質(zhì)量比1∶4稀釋，將菌體破碎后，離心得到的上清液為胞內(nèi)酶粗提液[23]，沉淀為菌體碎片。分別將上清液、沉淀、混合體（上清液沉淀）加入總體積20 mL的NDMA模擬體系中反應(yīng)，同時設(shè)置空白對照組，測定NDMA最終的形成量。

1.3.4.6 對乳酸菌培養(yǎng)方式、菌體碎片添加量的篩選

分別使用4 種MRS液體培養(yǎng)基：不添加誘導(dǎo)劑；添加10 μg/mL NaNO2；添加0.04 μg/mL NAS；添加 10 μg/mL NaNO20.04 μg/mL NAS，擴(kuò)增培養(yǎng)PROMIX5，經(jīng)1.3.4.5節(jié)相同方法處理得到菌體碎片，按照濕質(zhì)量分別以0.2%、0.5%、1%、1.5%、2%的比例加入形成NDMA的模擬體系中反應(yīng)，同時做空白對照，最終得到不同培養(yǎng)方式以及添加量對NDMA形成的影響。

1.3.4.7 PRO-MIX5菌體碎片在紅腸和培根中的應(yīng)用效果

使用相對較低的添加量將菌體碎片分別以0.05%、0.25%、0.5%的比例（濕質(zhì)量）應(yīng)用于紅腸和培根的制作中，同時設(shè)置空白對照組，即不添加菌體碎片，分別測定4 組產(chǎn)品中9 種N-亞硝胺含量。

1.3.5 指標(biāo)測定方法

1.3.5.1 亞硝酸鹽的測定

參照李秀明等[24]的毛細(xì)管電泳法測定亞硝酸鹽殘留量。

1.3.5.2 N-亞硝胺的測定

參照GB 5009.26ü 2016《食品中N-亞硝胺類化合物的測定》[25]對品中的N-亞硝胺進(jìn)行提取、萃取凈化、濃縮后過膜。氣相色條件：進(jìn)量1 μL；進(jìn)口溫度250 ℃；柱箱升溫梯度為50 ℃保持4 min，10 ℃/min速率升至180 ℃保持2 min，20 ℃/min 升至220 ℃，保持10 min，后運(yùn)行以235 ℃保持2 min；氮磷檢測器溫度330 ℃；氫氣流速2 mL/min，空氣流速60 mL/min，載氣（N2）流速6 mL/min。將過膜 后的品用該氣相色條件測定9 種N-亞硝胺，同時進(jìn)行分析定量。

1.3.5.3 pH值的測定

參照GB 5009.237ü 2016《食品pH值的測定》[26]的方法進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 在肉培養(yǎng)基中培養(yǎng)PRO-MIX5

2.1.1 發(fā)酵代謝產(chǎn)物對亞硝酸鹽的降解作用

在肉制品加工中常添加亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽是形成致癌物N-亞硝胺的前體物。乳酸菌代謝產(chǎn)物常存在于發(fā)酵上清液中，其中含有大量乳酸、乳酸菌、過氧化氫等物質(zhì)[27]。如圖2所示，隨著作用時間的延長和添加濃度的增加，發(fā)酵上清液和混合發(fā)酵液均不能顯著降解體系中的亞硝酸鹽含量。

圖 2 發(fā)酵上清液和混合發(fā)酵液添加量對模擬體系中亞硝酸鹽的降解作用Fig. 2 Effects of fermentation supernatant and fermentation broth on degradation of nitrite in simulated system

如圖3所示，在4 ℃和35 ℃條件下添加發(fā)酵上清液的模擬體系中亞硝酸鹽含量隨著反應(yīng)時間的延長均未顯著降低，可知隨著發(fā)酵上清液添加量的增加、反應(yīng)溫度的提高和反應(yīng)時間的延長，菌體發(fā)酵的代謝產(chǎn)物依然沒有顯著降解亞硝酸鹽的效果，綜上結(jié)果說明在發(fā)酵時能夠起到降解亞硝酸鹽的物質(zhì)并不存在于乳酸菌的發(fā)酵代謝產(chǎn)物中。

圖 3 溫度對模擬體系中亞硝酸鹽的降解作用Fig. 3 Effect of temperatures on degradation of nitrite in simulated system

2.1.2 乳酸菌胞內(nèi)酶釋放后對亞硝酸鹽的降解作用

張馨月等[21]報道，LCR6013中降解亞硝酸鹽主要為亞硝酸鹽還原酶的作用，且該酶屬于胞內(nèi)酶，主要存在于細(xì)胞同質(zhì)間隙，對亞硝酸鹽降解作用顯著，其次為細(xì)胞質(zhì)酶和細(xì)胞碎片。按照1.3.4.2節(jié)的實驗方法制備乳酸菌發(fā)酵液，其中在培養(yǎng)基中添加亞硝酸鹽的目的是作為誘導(dǎo)劑促進(jìn)降解亞硝酸鹽的物質(zhì)產(chǎn)生，且其添加量對降解效果相關(guān)性較大[28]。按照表1的方法步驟對乳酸菌發(fā)酵液處理后進(jìn)行實驗，結(jié)果如圖4所示。實驗結(jié)果表明，由PRO-MIX5制得的混合發(fā)酵液、沉淀與水混合物、沉淀與PBS混合物、乳酸組發(fā)酵液隨著反應(yīng)時間的延長，均能對亞硝酸鹽起到降解作用（P＜0.05），且不同處理方式對亞硝酸鹽降解率由大到小順序依次為：沉淀與水混合物＞混合發(fā)酵液＞乳酸組發(fā)酵液＞沉淀與PBS混合物，其中混合發(fā)酵液和沉淀與水混合物處理方式在保溫反應(yīng)過程中對亞硝酸鹽降解率具體如表2所示，說明將細(xì)胞破碎釋放出胞內(nèi)酶后，對亞硝酸鹽降解作用顯著，但沉淀與水混合物降解效果優(yōu)于混合發(fā)酵液是由于胞內(nèi)酶釋放后不穩(wěn)定[29]，且可能受到上清液中代謝產(chǎn)物如過氧化氫的作用影響了其活性，而用水取代發(fā)酵上清液后破碎菌體則能較好地使胞內(nèi)酶和菌體碎片發(fā)揮作用，在保溫2 h時對亞硝酸鹽的降解率可達(dá)53.49%，相反，用 0.01 mol/L、pH 7.4的PBS并不能更好地維持亞硝酸鹽還原酶的穩(wěn)定性，反而使酶活性大大下降，結(jié)果與文獻(xiàn)[21]結(jié)果不一致，可能是由于菌種的不同，對PBS的pH值和濃度的耐受性也不同。

圖 4 PRO-MIX5胞內(nèi)酶釋放后對亞硝酸鹽的作用情況 Fig. 4 Effect of PRO-MIX5 on nitrite degradation after release of intracellular enzymes

表 2 混合發(fā)酵液和沉淀與水混合物在保溫反應(yīng)過程中 對亞硝酸鹽的降解率Table 2 Degradation percentages of nitrite by fermentation broth and mixture of precipitate and water at constant reaction temperature

2.1.3 混合發(fā)酵液和沉淀與水混合物對NDMA形成的影響

目前國標(biāo)中僅規(guī)定肉制品中NDMA殘留量不能超過3 μg/kg[30]，因以形成NDMA的模擬體系對微生物抑制劑的制作進(jìn)一步篩選。如表3所示，混合發(fā)酵液和沉淀與水混合物均極大地促進(jìn)了NDMA的形成，這可能是由于本步驟采用的是肉培養(yǎng)基，且經(jīng)過接菌發(fā)酵后，蛋白質(zhì)降解使體系中含有級胺類物質(zhì)，為N-亞硝胺的形成提供了大量的前體物[31]?；旌习l(fā)酵液對NDMA形成的促進(jìn)能力顯著高于沉淀與水混合物（P＜0.05），且其促進(jìn)能力幾乎為沉淀與水混合物的2 倍（表3）。由于沉淀與水混合物已離心除去上清液，由說明該發(fā)酵劑的代謝產(chǎn)物中可能存在著能夠促進(jìn)NDMA形成的物質(zhì)，因而所制備的發(fā)酵液沉淀中可能存在能夠抑制NDMA形成的物質(zhì)，且該物質(zhì)可能存在于菌體中。

表 3 混合發(fā)酵液和沉淀與水混合物對NDMA形成的影響Table 3 Effects of fermentation broth and mixture of precipitate and water on the formation of NDMA

2.2 PRO-MIX5培養(yǎng)

2.2.1 不同處理方式的菌體對NDMA形成的影響

表 4 處理方式對NDMA形成的影響Table 4 Effects of treatment on NDMA formation

如表4所示，4 種作用方式均不同程度地促進(jìn)NDMA形成，但促進(jìn)效果遠(yuǎn)低于2.1.3節(jié)的結(jié)果，其中活菌在模擬體系中保溫2 h，NDMA形成量明顯高于其他3 組，且添加活菌直接亞硝化反應(yīng)組中NDMA形成量也高于死菌組，說明在活菌保溫2 h的過程中以及在80 ℃中反應(yīng)，活菌可能產(chǎn)生了一些能夠促進(jìn)NDMA形成的物質(zhì)。而死菌在模擬體系中保溫2 h對NDMA促進(jìn)效果幾乎一致，且促進(jìn)率較低，對比活菌結(jié)果，推測菌體中可能含有抑制 N-亞硝胺形成的物質(zhì)，且該物質(zhì)不是一種活性蛋白酶，具有一定耐熱性。

2.2.2 菌體不同組分對NDMA形成的影響

表 5 PRO-MIX5菌體經(jīng)破碎后不同位置的產(chǎn)物對NDMA形成的影響Table 5 Effect of broken cells versus supernatant of PRO-MIX5 on the formation of NDMA

如表5所示，沉淀組，即添加PRO-MIX5的菌體碎片（包含細(xì)胞壁碎片、細(xì)胞膜碎片、細(xì)胞器、包涵體等物質(zhì)）對NDMA的形成具有顯著的抑制效果，可能是由于菌體碎片對N-亞硝胺具有一定的吸附作用[18,32]，但其具體機(jī)理仍需進(jìn)一步深入研究；上清液和混合體則促進(jìn)了NDMA形成，其中混合體組促進(jìn)效果顯著大于上清液，說明沉淀物菌體碎片的存在可能會增加上清液對NDMA形成的促進(jìn)作用，其具體相互作用的機(jī)理亟待研究。

2.2.3 對乳酸菌培養(yǎng)方式、菌體碎片添加量的篩選

如表6所示，使用添加0.04 μg/mL NAS的MRS培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)PRO-MIX5，得到的菌體碎片對NDMA形成的抑制效果最佳，隨著添加量的變化，對NDMA的抑制效果較為穩(wěn)定，且在篩選的幾個添加量范圍內(nèi)添加量越低，NDMA的形成量越低，可使用添加量范圍較廣，以作為為本實驗篩選出的抑制NDMA形成效果較好的抑制物質(zhì)，進(jìn)一步應(yīng)用于實際產(chǎn)品的加工中。

表 6 不同培養(yǎng)方式所制得的菌體碎片以及不同添加量 對NDMA形成的影響Table 6 Effect of addition of NaNO2 and/or NAS at different levels to MRS medium on the formation of NDMA μg/mL

2.3 PRO-MIX5菌體碎片在紅腸和培根中的應(yīng)用效果

表 7 PRO-MIX5菌體碎片對9 種N-亞硝胺形成的影響Table 7 Effects of addition of PRO-MIX5 debris on the formation of nine N-nitrosamines μg/kg

根據(jù)表7，相比CK組，在紅腸中添加0.05%和0.5%的菌體碎片能夠顯著降低產(chǎn)品中NDMA的形成，抑制率分別為53.03%和63.52%，其中以0.05%添加量對9 種N-亞硝胺總形成量的抑制效果最佳，抑制率可達(dá)到41.04%、0.25%和0.5%添加量對9 種N-亞硝胺總形成量抑制率分別為16.13%和13.48%。在培根中添加0.05%的菌體碎片抑制N-亞硝胺的效果相對較好，對NDMA形成的抑制率為27.58%，對9 種N-亞硝胺形成總量的抑制率為13.83%，而0.25%和0.5%添加量無顯著抑制效果。說明所制得的菌體碎片不僅能夠抑制產(chǎn)品中N-亞硝胺的形成，且在較低添加量下就能起到抑制作用，應(yīng)用效果良好。

3 結(jié) 論

PRO-MIX5的菌體碎片具有抑制N-亞硝胺形成的效果，且使用添加0.04 μg/mL NAS的MRS肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)PRO-MIX5，經(jīng)過4 ℃、5 000h g離心15 min得到菌體，用25 mmol/L，pH 6的PBS沖洗菌體2 次，再以該P(yáng)BS以1∶4的比例稀釋，添加終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶菌酶作用后，超聲波破碎5 min，經(jīng)4 ℃、10 000h g離心10 min得到的沉淀（菌體碎片）為能夠有效抑制N-亞硝胺形成的物質(zhì)；以添加量均為0.05%應(yīng)用于紅腸和培根的加工中，對9 種N-亞硝胺形成的總量抑制效果相對較好，阻斷率分別為41.04%和13.83%，研究結(jié)果對肉制品安全控制方面具有重要意義。