李強(qiáng)坤，柳陳堅(jiān)，羅義勇，楊 恩，李曉然

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500）

葉酸，也稱為VB9，在嘌呤、甲酰甲硫氨酸、胸腺嘧啶、泛酸、甘氨酸、絲氨酸和蛋氨酸合成過程中作為一種碳轉(zhuǎn)移反應(yīng)的輔因子，對于人體健康極為重要[1]。作為一碳供體，葉酸參與核苷酸生物合成過程中發(fā)生的甲基化和甲?；磻?yīng)[2]。在妊娠期，如果缺乏葉酸將損害胚胎組織中的DNA合成，導(dǎo)致細(xì)胞分裂率降低[3]。植物、真菌、某些原生動物和大多數(shù)細(xì)菌可以從頭開始合成葉酸，但高等動物缺乏葉酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶[4]。生物來源的葉酸多為多聚谷氨酸葉酸，而化學(xué)合成的葉酸膳食補(bǔ)充劑則多為單谷氨酸葉酸，然而，在生物體內(nèi)，大多數(shù)依賴葉酸的酶更傾向于使用多聚谷氨酸葉酸而不是單體谷氨酸葉酸[5]。因，對于人體來說，從膳食中攝入葉酸比直接通過化學(xué)制劑攝取更有優(yōu)勢。

在細(xì)菌和植物等模式生物中，葉酸合成和補(bǔ)救途徑已經(jīng)被廣泛研究，并且在細(xì)菌和植物主要通過誘導(dǎo)相關(guān)基因高表達(dá)提高其葉酸產(chǎn)量[6-8]。乳酸菌是一類低GC含量的革蘭氏陽性菌，有助于改善食品品質(zhì)，改良風(fēng)味，并有助于改善營養(yǎng)和有利于人體健康，越來越多用于生產(chǎn)健康的功能性食品。但在乳酸菌中，Lactococcus lactis和Streptococcus thermophilus不能合成葉酸，研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）能產(chǎn)生葉酸[9-10]。L. plantarum可利用不同的食品基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，包括乳制品、蔬菜、淀粉類和肉類等[11-12]。L. plantarum可以產(chǎn)生 B族維生包括葉酸，且菌株合成葉酸的能力具有一定的差異性，如L. plantarum WCSF1具有較好的合成葉酸能力。產(chǎn)生葉酸的谷氨酸殘基數(shù)量和產(chǎn)量主要取決于菌株本身和培養(yǎng)條件[13]。在分析葉酸產(chǎn)量的研究中，大多關(guān)注在培養(yǎng)末期葉酸的最終產(chǎn)量，而很少研究在其培養(yǎng)過程中葉酸產(chǎn)量發(fā)生的變化，對這些過程進(jìn)行深入了解對更好調(diào)控葉酸產(chǎn)量極為重要[8,14]。

在乳酸菌葉酸合成的兩條代謝支路中存在較多有調(diào)節(jié)作用的酶，在喋呤代謝支路中，三磷酸鳥苷（guanosine triohosphte，GTP）在環(huán)化水解酶I、氫新喋呤三磷酸焦磷酸酶（d i h y d r o n e o p t e r i n triphosphate pyrophosphatase，DHNTPase）、氫新喋呤醛縮酶及6-羥甲基氫蝶呤焦磷酸激酶（6-hydroxymethyldihydropterin pyrophosphate kinase，DHPPK）的催化作用下合成6-羥甲基氫蝶呤焦磷酸（6-hydroxymethyldihydropterin pyrophosphate，DHPPP），這是葉酸生物合成的一個原料，該生物合成涉及的相關(guān)酶分別由folE、folQ、folB和folK基因編碼表達(dá)而成，DHPPP與對氨基苯甲酸（p-aminobenzoic acid，pABA）在氫蝶酸合酶（dihydropteroate synthase，DHPS）作用下結(jié)合生成氫蝶酸，該酶由folP基因編碼表達(dá)。這些基因在乳酸菌中通常以基因簇的形式存在，上述5 個基因的表達(dá)與否可直接影響整個代謝通路[15]。

本研究使用2 種基質(zhì)發(fā)酵，研究不同基質(zhì)對葉酸產(chǎn)生的影響。酸性條件下葉酸不穩(wěn)定，pH值低于4.5時會完全分解；而堿性或中性條件下葉酸較穩(wěn)定[16-17]，因，在本研究中，用1 株已發(fā)現(xiàn)的高產(chǎn)葉酸的L. plantarum 4-3對脫脂奶和豆?jié){兩種基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，通過調(diào)節(jié)其發(fā)酵過程中的pH值，探索不同發(fā)酵基質(zhì)以及pH值對葉酸產(chǎn)量和合成葉酸相關(guān)基因表達(dá)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從云南傳統(tǒng)發(fā)酵食品分離得到的L. plantarum 4-3菌株，保存于昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉 8.0 g，酵母提取物4.0 g，葡萄糖20.0 g，Tween-80 1 mL，磷酸氫鉀2.0 g，醋酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，七水硫酸鎂0.2 g，四水硫酸錳0.05 g，加蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌15 min，冷卻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

cowala脫脂奶購于GMP Dairy Limited公司，按10%的比例用蒸餾水溶解，105 ℃滅菌40 min。

豆?jié){：將溫水浸泡15 h的1 kg黃豆制備成原始豆?jié){，采用100 目篩對原始豆?jié){進(jìn)行過濾，并用純水將過濾后的豆?jié){稀釋至5 L，105 ℃滅菌40 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BIOFLO 415發(fā)酵罐 德國Eppendorf公司；Applied Biosystems 7300實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）系統(tǒng) 美國Thermo Fisher公司；QTRAP?4500高效液相色-質(zhì)聯(lián)用儀 美國AB Sciex公司。

1.3 方法

1.3.1 L. plantarum 4-3菌株發(fā)酵條件

取冷凍保存的L. plantarum 4-3菌株解凍，涂布后37 ℃培養(yǎng)，挑取單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，按1%比例接種至5 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)12 h，再將其按1%接種至50 mL MRS培養(yǎng)基中，37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)12 h，通過活菌計數(shù)法計菌液濃度，按107CFU/mL的終濃度將其接種至5 L脫脂奶或豆?jié){中，37 ℃、150 r/min發(fā)酵。在控制pH值發(fā)酵過程中，使用10 mol/L NaOH溶液使MRS發(fā)酵液pH值維持在6.0。

1.3.2 L. plantarum 4-3菌株生長動態(tài)監(jiān)測

1.3.3 葉酸合成相關(guān)基因表達(dá)量測定

取L. plantarum 4-3菌株12、24、36、48 h發(fā)酵液進(jìn)行RNA提取，使用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司），使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（南京諾唯贊生物科技有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后進(jìn)行熒光實(shí)時定量PCR（quantitative PCR，qPCR）測定L. plantarum 4-3葉酸合成相關(guān)基因表達(dá)情況。qPCR所使用的引物均為本研究自行設(shè)計，具體序列信息見表1，使用ChamQTMSYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）對反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，以16S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參，每個品做3 個重復(fù)，經(jīng)過梯度PCR測試。雖然每對引物溶解溫度不完全一，但在60 ℃退火溫度條件下均能達(dá)到較好的擴(kuò)增效率，因擴(kuò)增程序統(tǒng)一為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃復(fù)性30 s，擴(kuò)增40 個循環(huán)后置于4 ℃保存。qPCR結(jié)果用ΔΔCt代表相對表達(dá)量，以MRS培養(yǎng)基中12 h品各個基因表達(dá)量作對照。

表 1 qPCR所使用引物及擴(kuò)增效率Table 1 Sequences of primers used in qPCR and their amplification efficiency

1.3.4 葉酸含量測定

取L. plantarum 4-3在12、24、36、48、60、72、84、96 h發(fā)酵液超聲破碎10 min，12 000 r/min離心5 min，將處理好的品用高效液相色-質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行葉酸含量測定。質(zhì)條件：氣簾氣壓力25 psi，碰撞氣中等，離子源氣1壓力45 psi，離子源氣2壓力50 psi，電噴霧電壓5 500 V，加熱器溫度350 ℃，選用正離子模式進(jìn)行檢測，離子源為電噴霧電離源。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，使用GraphPad Prism 6軟件對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 L. plantarum 4-3發(fā)酵過程中生長特性

L. plantarum在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，使得培養(yǎng)環(huán)境處于酸性條件，微生物細(xì)胞對pH值的改變非常敏感，即使是乳酸菌，在較低pH值條件下也會抑制其生命活動[17-18]。用脫脂奶發(fā)酵時，42 h的pH值降到最低，約為3.9（圖1A）；而以豆?jié){為發(fā)酵基質(zhì)時，12 h時pH值降到最低，約為4（圖1B）。熊濤等[19]研究發(fā)現(xiàn)，pH值控制在5.8～6.3之間，乳酸菌活菌數(shù)最高，不在范圍內(nèi)的乳酸菌生長的活菌數(shù)較低，特別是控制pH 4.8～5.3內(nèi)活菌數(shù)最低。在本研究中，使用可以自動監(jiān)測并調(diào)節(jié)pH值的發(fā)酵罐培養(yǎng)，在整個培養(yǎng)周期內(nèi)pH值維持在6.0時，不僅延長了平臺期，而且在較長時間內(nèi)維持較高的活菌數(shù)。在沒有調(diào)節(jié)pH值的情況下，L. plantarum達(dá)到穩(wěn)定期后在較短時間內(nèi)活菌數(shù)迅速減少（圖1），結(jié)果表明，調(diào)節(jié)pH值保持在6.0可以使L. plantarum 4-3菌株細(xì)胞死亡速度降低，使培養(yǎng)基內(nèi)的活細(xì)胞密度長時間維持在較高水平。外，從菌株生長曲線可知，當(dāng)以豆?jié){為發(fā)酵基質(zhì)且維持pH 6.0時， L. plantarum 4-3達(dá)到穩(wěn)定期的時間最短，且維持穩(wěn)定期的時間最長，有利于次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。

圖 1 L. plantarum 4-3的脫脂奶（A）和豆?jié){（B）發(fā)酵pH值及 活菌數(shù)動態(tài)變化Fig. 1 Dynamic changes in pH and viable cell count during culture of L. plantarum 4-3 in skim milk (A) and soybean milk (B)

2.2 L. plantarum 4-3葉酸產(chǎn)量

圖 2 L. plantarum 4-3發(fā)酵的脫脂奶（A）和豆?jié){（B）葉酸含量Fig. 2 Change in folate concentration in skim milk (A) and soybean milk (B) inoculated with L. plantarum 4-3

臨床推薦孕婦葉酸攝入量為400 μg/d，但主要補(bǔ)充化學(xué)合成葉酸，研究表明，化學(xué)合成葉酸存在一定的副作用[22-23]；因，雖然L. plantarum 4-3發(fā)酵的脫脂奶和豆?jié){不能提供足夠的葉酸，但可以作為天然葉酸的膳食補(bǔ)充劑。與其他L. plantarum野生型菌株相比[8]，本研究發(fā)酵條件下，葉酸產(chǎn)量更高，尤其是在基因改造菌株難以直接進(jìn)入食品的情況下，對其發(fā)酵條件進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化獲得更多的生物合成葉酸產(chǎn)量極為必要[24-25]。

2.3 L. plantarum 4-3合成葉酸基因表達(dá)量

圖 3 L. plantarum 4-3發(fā)酵的脫脂奶（A）和豆?jié){（B）葉酸合成中 主要基因的相對表達(dá)量Fig. 3 Expression levels of major genes involved in folate biosynthesis in L. plantarum 4-3 cultured in skim milk (A) and soybean milk (B)

為研究在培養(yǎng)過程中pH值對葉酸合成相關(guān)基因的影響，使用qPCR方法對葉酸生物合成過程中合成DHPPP和氫蝶酸的主要基因進(jìn)行定量檢測。

圖3顯示，在pH 6.0條件下，葉酸相關(guān)合成基因在脫脂奶和豆?jié){兩種基質(zhì)中的表達(dá)均顯著提高，當(dāng)維持pH 6.0時，葉酸分別在第36小時和第24小時開始積累，說明pH 6.0有利于葉酸的合成。Sybesma等[26]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌中的DHPPK與GTP環(huán)化水解酶I是由一個folKE基因編碼的雙功能蛋白，過量表達(dá)該基因可以使胞外葉酸從 10 ng/mL明顯增加到80 ng/mL；folE基因編碼的GTP環(huán)化水解酶I是喋呤代謝支路反應(yīng)的第1步，也是限速步驟[27]。維持pH 6.0發(fā)酵時，在脫脂奶和豆?jié){兩種基質(zhì)中folE基因表達(dá)量顯著提高，但與其他基因相比其表達(dá)量相對較低，可能限制了葉酸的合成。folQ基因編碼DHNTPase，據(jù)報道，目前只在乳酸菌和植物中被發(fā)現(xiàn)[28-29]。然而大部分乳桿菌屬的乳酸菌中沒有folQ基因，使該類乳酸菌不能有效合成葉酸[30-32]。結(jié)果顯示，L. plantarum 4-3在兩種基質(zhì)中都具有較高的表達(dá)量；DHPS由folP基因編碼表達(dá)，梁業(yè)紅[33]研究表明，過量表達(dá)細(xì)菌中的folP基因可以顯著提高擬南芥植株的葉酸含量。外，DHPS催化合成的底物氫蝶酸對DHPS有強(qiáng)烈的抑制作用[34]，因過量表達(dá)folP基因可能提高了氫蝶酸的含量，但氫蝶酸被競爭性地用于葉酸的合成和抑制DHPS的活性，兩種反應(yīng)競爭的結(jié)果導(dǎo)致葉酸的合成速度只能有限度增加。folP基因在兩種基質(zhì)中都有很高的表達(dá)量，但葉酸含量相對較低，也可能是由反饋抑制造成的。

葉酸合成的其他基因，如pABA合成通路上的相關(guān)基因，也與葉酸產(chǎn)量密切相關(guān)。pABA是葉酸的重要前體[13]，較多葉酸合成的研究在培養(yǎng)基中額外添加pABA提高葉酸產(chǎn)率[14,24]。后續(xù)研究將深入分析支路對 L. plantarum葉酸合成的影響，為開發(fā)富含葉酸的發(fā)酵食品提供理論支持。

3 結(jié) 論

L. plantarum是應(yīng)用廣泛的益生菌，其可以合成葉酸的特性賦予了這類細(xì)菌更好的應(yīng)用價值。乳酸菌葉酸相關(guān)合成基因數(shù)量很多，發(fā)酵條件對葉酸的合成影響很大。結(jié)果顯示，與脫脂奶相比，用豆?jié){發(fā)酵能產(chǎn)生更多的葉酸。外，L. plantarum在生長過程中持續(xù)產(chǎn)生有機(jī)酸使得培養(yǎng)基的pH值降低，將pH值穩(wěn)定在6.0有利于細(xì)菌長時間保持高密度生長，在條件下，葉酸合成相關(guān)基因也有較高的表達(dá)，大大提高了葉酸的生產(chǎn)水平。