趙靜麗，劉遠(yuǎn)遠(yuǎn)，馬美湖

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，國家蛋品加工技術(shù)研發(fā)中心，湖北 武漢 430070）

我國是世界上蛋類生產(chǎn)最多的國家，蛋品加工產(chǎn)生的蛋殼量十分巨大[1]。每年大量廢棄蛋殼在未經(jīng)任何預(yù)處理的情況下被丟棄，殘留的蛋清和其他物質(zhì)容易引起微生物污染和嚴(yán)重的環(huán)境問題，并且造成資源浪費(fèi)[2]。因此，提高蛋殼廢棄物的利用價(jià)值已成為研究的熱點(diǎn)。

蛋殼組成中約含有93%的碳酸鈣，以及少量碳酸鎂、磷酸鈣等[3]。雞蛋殼中含有豐富的鈣，是一種天然的綠色鈣源，可用作碳酸鈣材料，形成不同的鈣鹽，如檸檬酸鈣、葡萄糖酸鈣和乳酸鈣[4]。而蛋殼乳酸鈣與其他有機(jī)鈣鹽相比具有良好的溶解性和生物利用度[5-6]。目前蛋殼乳酸鈣主要可以通過煅燒[7]、直接中和或發(fā)酵方法制成，與前兩種方法相比，發(fā)酵方法具有綠色無污染且成本低的優(yōu)勢(shì)，符合我國的可持續(xù)發(fā)展方向[8]。然而，微生物發(fā)酵法制備乳酸鈣產(chǎn)率低，這很大程度限制了蛋殼廢物的有效利用。

為提高微生物發(fā)酵產(chǎn)乳酸鈣的能力，實(shí)驗(yàn)室前期開展大量的菌種選育工作，從長(zhǎng)期深埋廢棄蛋殼的土壤中分離1 株具有較強(qiáng)產(chǎn)乳酸鈣能力的菌株蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）。為進(jìn)一步提高乳酸鈣產(chǎn)量，采用固定化細(xì)胞技術(shù)。固定化細(xì)胞技術(shù)是在固定化酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，常用于獲得高密度細(xì)胞[9-11]，與傳統(tǒng)發(fā)酵相比，固定化細(xì)胞發(fā)酵具有連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)。在工業(yè)規(guī)模上，細(xì)胞固定可以有效地增加發(fā)酵罐中細(xì)胞濃度，改善細(xì)胞的操作穩(wěn)定性，并減少下游處理[12-13]。選擇合適的固定化載體對(duì)于固定化技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中具有重要意義，目前常用的載體為海藻酸鈉（sodium alginate，SA）， 由于其固定的微生物具有生物活性高、制備簡(jiǎn)單、對(duì)生物的毒性小等被廣泛使用[14-15]，其形成凝膠的機(jī)理是SA中鈉離子被氯化鈣中鈣離子置換形成海藻酸鈣。但是，在實(shí)際應(yīng)用中由于發(fā)酵液中存在磷酸鹽體系，易使 鈣離子脫落，從而導(dǎo)致載體破裂和細(xì)胞泄露，不利于其應(yīng)用[16]。已有研究報(bào)道，藻酸鹽凝膠可以通過添加聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）與戊醛交聯(lián)反應(yīng)或發(fā)酵液中的其他鈣離子加強(qiáng)其機(jī)械穩(wěn)定性[17]。

考慮到蛋殼廢物的主要成分碳酸鈣可有效提供鈣離子，以解決SA-氯化鈣體系中機(jī)械穩(wěn)定性差的問題，采用SA、海藻酸鈉-聚乙烯醇（sodium alginate-polyvinyl alcohol，SA-PVA）、海藻酸鈉-活性炭（activated carbon，SA-C）作為包埋載體，通過比較其機(jī)械強(qiáng)度、傳質(zhì)系數(shù)、細(xì)胞操作穩(wěn)定性等指標(biāo)選擇最適的包埋載體，并對(duì)最適包埋載體的性質(zhì)進(jìn)行研究，以期為固定化細(xì)胞技術(shù)有效利用蛋殼廢物生產(chǎn)乳酸鈣提供一定的理論基礎(chǔ)，以實(shí)現(xiàn)工業(yè)連續(xù)發(fā)酵的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒙氏腸球菌CGMCC No. 8699由本實(shí)驗(yàn)室從長(zhǎng)期深埋廢棄蛋殼的土壤中分離。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.0 g，蛋白胨0.5 g，胰蛋白胨0.5 g，酵母提取物1.0 g，鹽溶液 4 mL，蒸餾水100 mL；發(fā)酵培養(yǎng)基：改良種子培養(yǎng)基，根據(jù)實(shí)驗(yàn)加入相應(yīng)的葡萄糖和蛋殼粉。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì) 美國熱電公司；真空干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司；恒溫振蕩搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；立式殺菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；多功能微生物自動(dòng)測(cè)量?jī)x 芬蘭Growthcurves Ab公司；質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋殼粉的制備

新鮮蛋殼用蒸餾水沖洗，除去表面污垢以及膜上殘留的蛋清液，1 mol/L NaCl溶液浸泡2 h后用蒸餾水沖洗，接著用100 mmol/L EDTA溶液，pH 8.5浸泡2 h，25 ℃烘干。將烘干后的蛋殼經(jīng)粉碎機(jī)短時(shí)（10 s）粉碎，200 目篩分出蛋殼粉，與水按料液比1∶10（g/mL）、 600 r/min攪拌15 min，溶液經(jīng)抽濾烘干得到蛋殼粉[18]。

1.3.2 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取蒙氏腸球菌液100 μL于MRS肉湯培養(yǎng)基中活化24 h，將已活化的菌液按2%的接種量接種于內(nèi)含100 mL種子培養(yǎng)基中，同時(shí)以種子培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，37 ℃振蕩培養(yǎng)，并于600 nm波長(zhǎng)處使用多功能微生物自動(dòng)測(cè)量?jī)x測(cè)定其生長(zhǎng)曲線。

1.3.3 細(xì)胞固定化方法

SA載體固定化：菌懸液與等體積SA溶液混合并攪拌5 min，SA質(zhì)量濃度為20 g/L，將混合溶液置于無菌注射器（5 mL）中并使其逐滴滴入100 mL 20 g/L CaCl2溶液中，并將小球放在37 ℃硬化30 min，然后用無菌蒸餾水洗滌以除去過量的鈣離子和未包埋的細(xì)胞，4 ℃保存?zhèn)溆肹19]。

SA-PVA載體固定化：菌懸液與等體積含70 g/L PVA和10 g/L SA的溶液混合，并使用滅菌注射器（5 mL）將混合溶液滴入20 g/L CaCl2溶液中以形成小球。小球在4 ℃貯存24 h后，用無菌蒸餾水洗滌以除去過量的鈣離子和未包埋的細(xì)胞，4 ℃保存?zhèn)溆肹20]。

SA-C載體固定化：菌懸液與等體積含10 g/L活性炭和30 g/L SA的溶液混合，并使用滅菌注射器（5 mL）將混合溶液滴入20 g/L CaCl2溶液中以形成小球。小球在4 ℃貯存24 h后，用無菌蒸餾水洗滌以除去過量的鈣離子和未包埋的細(xì)胞，4 ℃保存?zhèn)溆肹21]。

1.3.4 不同載體固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度和傳質(zhì)性能測(cè)定

機(jī)械強(qiáng)度測(cè)定采用質(zhì)構(gòu)儀。參數(shù)設(shè)置：探頭：P6；測(cè)試模式：TPA壓縮模式；觸發(fā)值：0.005 N；壓縮比：75%；測(cè)前速率、測(cè)試速率、測(cè)后速率均設(shè)為1.0 mm/s；下壓距離為10 mm，選取制備好的凝膠小球5～10 個(gè)進(jìn)行測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。

傳質(zhì)系數(shù)測(cè)定：參照任靜[22]的方法并稍作改動(dòng)，無菌條件下，在錐形瓶?jī)?nèi)裝有100 mL 1 mg/mL的葡萄糖溶液，并隨機(jī)取30 粒固定化小球浸泡，37 ℃浸泡24 h，并于540 nm波長(zhǎng)處采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測(cè)定浸泡前后錐形瓶中葡萄糖溶液OD值的變化，按式（1）計(jì)算固定化細(xì)胞的傳質(zhì)系數(shù)：

1.3.5 乳酸鈣含量的測(cè)定

采用EDTA定鈣法，離心取上清液1 mL，加蒸餾水50 mL，加1 mol/L NaOH溶液4 mL，鈣黃綠素指示劑20 mg，用0.05 mol/L EDTA-Na2溶液至背光觀察黃綠色熒光變?yōu)槌壬珵橹?，并記錄EDTA-Na2的體積。根據(jù)乳酸鈣折換為乳酸的系數(shù)為1.711，通過乳酸含量測(cè)定乳酸鈣[23]。

1.3.6 殘?zhí)呛康臏y(cè)定

采用DNS法測(cè)定發(fā)酵液中殘留的葡萄糖含量。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：用7 支25 mL比色管，分別加1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，蒸餾水補(bǔ)至2 mL，加入1.5 mL DNS試劑搖勻，沸水浴5 min，將冷卻至室溫。蒸餾水定容到25 mL，540 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。

1.3.7 發(fā)酵液中乳酸鈣的提取與蛋殼粉轉(zhuǎn)化率計(jì)算

菌種發(fā)酵完全后，將獲得的發(fā)酵液進(jìn)行過濾，以除去菌體和多余的蛋殼粉，將濾液加入氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH值至10左右，并加入1%的活性碳，于94 ℃除雜并脫色20 min。趁熱用布氏漏斗加雙層化學(xué)分析濾紙抽濾，收集濾液。將濾液放置于85 ℃濃縮至合適體積，冷卻靜置結(jié)晶24 h，分離晶體與母液，由于母液中還殘留大量的乳酸鈣，濃縮后再次結(jié)晶，晶體放置于70 ℃烘箱干燥至合適程度。蛋殼粉轉(zhuǎn)化率按式（2）計(jì)算[24]：

1.3.8 不同包埋載體固定化小球的微觀結(jié)構(gòu)觀察

將不同材料的固定化細(xì)胞置于2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定6 h，然后用無菌蒸餾水洗滌固定化細(xì)胞3 次，每次10 min，以去除戊二醛。洗滌后樣品依次浸泡于30%、50%、70%和90%乙醇溶液中進(jìn)行梯度脫水，每個(gè)梯度洗滌一次，每次10 min，最后用無水乙醇洗滌2 次，每次15 min，以移除最后的水分。將充分脫水后的樣品于冷凍干燥儀中進(jìn)行干燥，干燥后樣品粘在具有雙面膠帶的樣品臺(tái)上固定、噴金，最后使用掃描電鏡進(jìn)行觀察。

1.3.9 最適包埋載體分析

1.3.9.1 葡萄糖加入量對(duì)固定化細(xì)胞產(chǎn)乳酸鈣的影響

發(fā)酵液采用種子培養(yǎng)基改良，蛋殼粉80 g/L，設(shè)置6 組實(shí)驗(yàn)葡萄糖加入量分別為80、100、120、140、160、180 g/L，并接種后于37 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h，研究葡萄糖加入量對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響。

1.3.9.2 蛋殼粉加入量對(duì)固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度的影響

發(fā)酵液采用種子培養(yǎng)基改良，葡萄糖120 g/L，設(shè)置5 組實(shí)驗(yàn)蛋殼粉加入量分別為0、40、60、80、100 g/L，研究蛋殼粉加入量對(duì)固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度的影響，發(fā)酵條件同1.3.9.1節(jié)。

1.3.9.3 溫度、pH值對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響

設(shè)置溫度為18、23、28、33、38、43 ℃，pH值為4.3、5.7、6.8、7.6、8.7，探究溫度與pH值對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響。

1.3.9.4 固定化細(xì)胞的貯存穩(wěn)定性

將制備好的固定化小球保存于4 ℃的無菌生理鹽水中，每隔9 d測(cè)定其發(fā)酵蛋殼粉生產(chǎn)乳酸鈣產(chǎn)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因子方差分析，Duncan多重比較，各表中數(shù)值以f s表示，并使用Origin 2015軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙氏腸球菌的生長(zhǎng)曲線

圖 1 蒙氏腸球菌的生長(zhǎng)曲線和相應(yīng)的pH值變化Fig. 1 Growth curve of E. mundtii and corresponding pH evolution curve

由圖1可以看出，在2 h后，菌種開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，相應(yīng)的pH值也在急速下降，并在10 h左右達(dá)到穩(wěn)定期，其OD600nm值與pH值趨于穩(wěn)定。由于處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微生物代謝旺盛，生長(zhǎng)速率最大，在實(shí)際生產(chǎn)中通常選擇對(duì)數(shù)期的微生物作為種子，使微生物發(fā)酵的延遲期縮短，而用于固定化的微生物要求生長(zhǎng)旺盛，因此，實(shí)驗(yàn)選擇培養(yǎng)10～12 h的菌種進(jìn)行固定化，以提高微生物的利用效率。

2.2 不同載體固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度和傳質(zhì)系數(shù)

表 1 不同載體固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度與傳質(zhì)系數(shù)的比較Table 1 Comparison of mechanical strength and mass transfer coefficient of cells immobilized on different carriers

由表1可知，3 種載體中SA載體固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度值最大，而SA-PVA載體固定化細(xì)胞的傳質(zhì)系數(shù)值最大。在實(shí)際生產(chǎn)中，固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度較低時(shí)，其固定化顆粒內(nèi)部交聯(lián)結(jié)構(gòu)的致密程度低，利于增加其內(nèi)部傳質(zhì)，但易使被固定的細(xì)胞泄漏、凝膠球破碎，且固定之后經(jīng)過洗滌會(huì)造成菌體損失，從而不利于其發(fā)酵并失去連續(xù)發(fā)酵的意義。而當(dāng)機(jī)械強(qiáng)度較高時(shí)，凝膠過于緊密，會(huì)降低其傳質(zhì)性，不利于底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散，從而導(dǎo)致其發(fā)酵性能降低。因，固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度并不是越大（或?。?duì)發(fā)酵就越有利[25-26]。在比較3 種載體固定細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度及傳質(zhì)系數(shù)后，選擇載體為SA-C為宜。

2.3 游離細(xì)胞與不同載體固定化細(xì)胞生產(chǎn)乳酸鈣產(chǎn)量的比較

圖 2 游離細(xì)胞與不同載體固定化細(xì)胞生產(chǎn)乳酸鈣能力比較Fig. 2 Comparison of calcium lactate production by free cells and cells immobilized on different carriers

圖2 顯示，游離細(xì)胞與S A、S A-C 及S A-P VA 3 種載體固定化細(xì)胞隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，其乳酸鈣產(chǎn)量顯著增加（P＜0.05），并在72 h達(dá)到最大值，分別為（102.01f 2.56）、（96.33f 1.86）、（101.02f 1.83）、（76.09f 1.97）g/L，且SA-C載體的固定化細(xì)胞其乳酸鈣產(chǎn)量比其他2 種載體的乳酸鈣產(chǎn)量高，而與游離細(xì)胞相當(dāng)?？赡苁且?yàn)榛钚蕴烤哂写蟮谋砻娣e和低的傳質(zhì)阻力利于細(xì)胞生長(zhǎng)[27]，而在SA-PVA載體固定化細(xì)胞中觀察到低水平的乳酸鈣產(chǎn)生，可能是因?yàn)镻VA是一種高黏性物質(zhì)，在交聯(lián)過程中易于發(fā)生黏連現(xiàn)象，且PVA凝膠存在很大的水溶脹性，其機(jī)械強(qiáng)度低，在固定化過程中易發(fā)生細(xì)胞泄漏[28]，引起部分菌體損失，從而降低菌種發(fā)酵性能。

2.4 游離細(xì)胞與不同包埋載體固定化細(xì)胞的操作穩(wěn)定性

圖 3 不同載體的固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的重復(fù)分批發(fā)酵Fig. 3 Repeated usability of immobilized and free cells

為更好地確定包埋載體，對(duì)3 種載體固定化細(xì)胞及游離細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。僅在重復(fù)發(fā)酵9 次時(shí)，游離細(xì)胞中乳酸鈣產(chǎn)量與初始值相比降低近半，而SA-PVA載體固定化細(xì)胞機(jī)械穩(wěn)定性比較差，在發(fā)酵過程中有部分溶解，在重復(fù)使用12 次時(shí)已大部分溶解，不利于實(shí)際生產(chǎn)的使用。SA載體在重復(fù)使用18 次后，其乳酸鈣產(chǎn)量仍保留在80%以上，而SA-C載體在重復(fù)使用10 次之后，其發(fā)酵周期縮短為48 h即可達(dá)到 第1次產(chǎn)乳酸鈣的含量，并且由于發(fā)酵液中蛋殼粉的存在，可提供鈣離子，避免了固定化小球出現(xiàn)機(jī)械強(qiáng)度差的問題，始終維持著良好的機(jī)械穩(wěn)定性[29]。而SA-C載體顯示出比其他2 種載體更好的固定化效果，可能是因?yàn)樗峭ㄟ^包埋和吸附相結(jié)合使用復(fù)合固定化方法制備，克服了單一固定化技術(shù)的缺點(diǎn)[30]，固定化細(xì)胞的有效再利用可能是由于其酶活性高于游離細(xì)胞[31]，具有更高的細(xì)胞操作穩(wěn)定性。

2.5 不同載體固定化細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)

圖 4 固定化細(xì)胞的掃描電鏡圖Fig. 4 Scanning electron micrographs of immobilized cells

圖4A顯示，SA載體表面光滑，不利于其菌體細(xì)胞的附著；由圖4B可以看到，SA-C載體的表面粗糙，為固定在其上的菌體細(xì)胞提供良好的附著微環(huán)境；由圖4C可知，SA-PVA載體表面有許多空隙，具有較大的比表面積利于菌體細(xì)胞的附著。而觀察圖4D～F可知，SA、SA-C兩種包埋載體內(nèi)部均成功的附著有大量菌體細(xì)胞，且菌體細(xì)胞顆粒飽滿，而SA-PVA包埋載體內(nèi)部圖發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了許多小孔，且沒有發(fā)現(xiàn)菌體的附著，可能是由于PVA凝膠具有很大的水溶脹性，在處理品過程中導(dǎo)致其機(jī)械穩(wěn)定性差使得部分菌體細(xì)胞脫落，從而未觀察到；在重復(fù)發(fā)酵18 次后，由圖4G、H可知，SA-C與SA載體固定化細(xì)胞內(nèi)部相比聚集了更多的菌體細(xì)胞，且內(nèi)部構(gòu)造強(qiáng)度仍然很好，維持著高密度細(xì)胞發(fā)酵，有利于乳酸鈣產(chǎn)量的提高，這可能是其在重復(fù)發(fā)酵10 次后有縮短發(fā)酵周期趨勢(shì)的主要原因。因，最終選擇SA-C載體作為固定化蒙氏腸球菌的最適包埋載體。

2.6 葡萄糖加入量對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響

在確定SA-C作為最適包埋載體后，對(duì)發(fā)酵液中葡萄糖加入量對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響進(jìn)行探究，如圖5所示，隨發(fā)酵液中葡萄糖加入量增加，乳酸鈣產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在葡萄糖加入量為120 g/L時(shí)乳酸鈣產(chǎn)量最高，達(dá)（100.07f 2.58）g/L，且蛋殼粉轉(zhuǎn)化率為82.43%。隨著葡萄糖加入量的繼續(xù)增加反而使乳酸鈣產(chǎn)量降低，主要是由于發(fā)酵液中葡萄糖加入量過高時(shí)，對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)乳酸鈣速率的抑制也會(huì)增強(qiáng)[32]。因，綜合考慮選擇發(fā)酵液中的葡萄糖加入量為120 g/L。

圖 5 葡萄糖加入量對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響Fig. 5 Effect of glucose concentration on calcium lactate production

2.7 蛋殼粉加入量對(duì)固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度的影響

機(jī)械強(qiáng)度的穩(wěn)定性對(duì)于固定化細(xì)胞在長(zhǎng)期應(yīng)用中具有重要意義，機(jī)械強(qiáng)度太高，會(huì)阻礙營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，相反會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞滲漏、凝膠破裂[33]。由表2可知，發(fā)酵液中加入不同量蛋殼粉對(duì)固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度的影響具有顯著差異（P＜0.05）。在發(fā)酵72 h后，沒有加入蛋殼粉的固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度明顯降低，不利于實(shí)際應(yīng)用，易造成凝膠破裂、細(xì)胞滲漏。而發(fā)酵液中加入蛋殼粉的固定化細(xì)胞，由于蛋殼粉的存在，其主要成分是碳酸鈣，可為凝膠體系補(bǔ)充鈣離子從而防止凝膠體系中的鈣離子因被發(fā)酵液中磷酸鹽等離子置換出來，而導(dǎo)致凝膠體系破裂的現(xiàn)象。結(jié)果說明蛋殼粉的存在有效維持了固定化細(xì)胞在長(zhǎng)期發(fā)酵過程中的機(jī)械穩(wěn)定性[29]。

表 2 蛋殼粉加入量對(duì)固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度的影響Table 2 Effect of eggshell powder content on mechanical strength of immobilized cells

2.8 溫度和pH值對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響

圖 6 溫度（A）和pH值（B）對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響Fig. 6 Effect of temperature (A) and pH (B) on calcium lactate production

如圖6A所示，游離細(xì)胞與固定化細(xì)胞的最適溫度相同，乳酸鈣產(chǎn)量均在38 ℃時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)溫度過高或者過低時(shí)，均不利于乳酸鈣的生成，而固定化細(xì)胞對(duì)不同溫度的適應(yīng)能力明顯高于游離細(xì)胞。如圖6B所示，在最適反應(yīng)溫度條件下，游離細(xì)胞與固定化細(xì)胞最適宜的pH值都為5.7，說明固定化以后沒有改變蒙氏腸球菌生長(zhǎng)適宜的pH值，而在pH值過低或過高時(shí)，固定化細(xì)胞生產(chǎn)乳酸鈣的能力高于游離細(xì)胞，說明將細(xì)胞固定化之后提高了其pH值穩(wěn)定性。

2.9 固定化細(xì)胞的貯存穩(wěn)定性

將固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞分別置于無菌生理鹽水中，于冰箱中4 ℃保存。如圖7所示，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化細(xì)胞的貯存穩(wěn)定性明顯高于游離細(xì)胞，且在4 ℃冷藏54 d后，乳酸鈣產(chǎn)量與新制備的固定化細(xì)胞相比僅下降13.45 g/L，由說明固定化細(xì)胞具有良好的貯存穩(wěn)定性。

圖 7 游離細(xì)胞與固定化細(xì)胞的貯存穩(wěn)定性Fig. 7 Storage stabilities of free and immobilized cells

3 結(jié) 論

本研究采用固定化細(xì)胞技術(shù)利用蛋殼廢物生產(chǎn)乳酸鈣，對(duì)固定化包埋載體進(jìn)行探討，并確定SA-C作為最適包埋載體，其產(chǎn)乳酸鈣能力與游離細(xì)胞相當(dāng)，在重復(fù)發(fā)酵18 次后仍維持高產(chǎn)率的乳酸鈣。而發(fā)酵液中蛋殼廢物的存在既維持了固定化細(xì)胞的機(jī)械穩(wěn)定性，又與乳酸充分結(jié)合生成乳酸鈣，有效提高了蛋殼廢物的利用。與游離細(xì)胞相比，固定化細(xì)胞的操作穩(wěn)定性、溫度、pH值及貯存穩(wěn)定性在一定范圍內(nèi)都有明顯的提高，為利用固定化細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)蛋殼乳酸鈣提供一定的理論支持，且所制得的凝膠球可滿足連續(xù)化發(fā)酵生產(chǎn)工藝的要求。