趙巖巖，趙圣明,2,，李 帥，康壯麗,2，王正榮,2，朱明明,2，趙 璐，馬漢軍,2，何鴻舉,2

（1.河南科技學院食品學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省畜禽產(chǎn)品精深加工與質量安全控制工程技術研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.吉林農(nóng)業(yè)科技學院食品工程學院，吉林 吉林 132101）

乳和乳制品由于其富含蛋白質、乳糖、礦物質和維生素等營養(yǎng)物質，目前已經(jīng)成為人們飲食結構當中重要的組成部分[1]。許多國家人們都在大量的消費乳制品，但是常見的鮮乳或乳粉中功能活性物質的種類較少，已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代消費者對于營養(yǎng)保健的需要。而發(fā)酵乳制品不僅保留了原乳的營養(yǎng)品質，并且經(jīng)過發(fā)酵后具有良好的風味以及能產(chǎn)生多種有益健康的功能成分，如乳酸菌代謝產(chǎn)生多種人體必須的維生素，可以滿足人體的營養(yǎng)需要，同時還可產(chǎn)生多種酶類、多肽類和多糖類等，不僅具有清除自由基起到抗氧化延緩衰老的作用，而且還具有提高機體免疫力、維持腸道菌群平衡、防止便秘、降低膽固醇[2]、降血壓及抗癌等多種功效[3-5]。此外還能通過發(fā)酵過程中分解乳中的乳糖，從而緩解由于乳糖不耐癥所引起的腹痛、腹泄等腹部不適癥狀。因此，目前發(fā)酵乳已經(jīng)成為深受人們喜愛的功能保健食品[6-7]。

目前，國內外學者已經(jīng)將多種天然產(chǎn)物應用于功能發(fā)酵乳的開發(fā)研究中，如沙棘[8]、藍莓[9]、紫薯提取物[10]， 螺旋藻[11]、山核桃[12]等，用于改善發(fā)酵乳的風味和品質量，以及增加其保健功能等。同時也有許多研究將杏鮑菇多糖[13]、靈芝多糖[14]、松茸多糖[15]、紅棗多糖[16]和凝膠多糖[17]等應于發(fā)酵乳的研究開發(fā)中，結果發(fā)現(xiàn)不僅可以改善發(fā)酵乳的感官品質，還可以提供益生菌活性以及提高發(fā)酵乳的抗氧化活性等。此外由于多數(shù)多糖化合物都具有一些特殊的生理活性，如枸杞多糖、松茸多糖、藠頭多糖和松花粉多糖等具有抗氧化、免疫調節(jié)和腫瘤等功效[18]，因此將活性多糖用于功能性發(fā)酵乳的開發(fā)具有廣闊的應用前景。山楂葉多糖是一種功能活性多糖，具有降血壓、降血脂和抗氧化等活性功能[19-20]，目前國內對山楂葉多糖的研究僅限于提取工藝方面[20-21]， 而關于山楂葉多糖對發(fā)酵乳品質影響的研究鮮見相關報道。且河南新鄉(xiāng)南太行山區(qū)野生山楂樹資源豐富，將山楂葉變廢為寶，開發(fā)山楂葉作為功能活性物質的新來源，提取山楂葉多糖用于開發(fā)功能性食品，具有廣闊的市場前景。本研究以山楂葉多糖和發(fā)酵乳為研究對象，通過測定不同添加量山楂葉多糖發(fā)酵乳的乳度、乳酸菌活菌數(shù)、持水力、質構、流變和抗氧化活性等，研究山楂葉多糖對益生菌發(fā)酵乳的品質影響，為新型山楂葉多糖益生保健發(fā)酵乳的開發(fā)提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

山楂葉采自新鄉(xiāng)南太行山山區(qū)；生鮮牛乳購自河南省新鄉(xiāng)市段村奶牛養(yǎng)殖場。發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、鼠李糖乳桿菌）為河南科技學院食品微生物實驗室保藏。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

水楊酸、鐵氰化鉀 國藥集團化學試劑有限公司；硫酸亞鐵 天津科密歐試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海 阿拉丁試劑有限公司；三氯乙酸 上海山浦化工有限 公司；其他試劑均為市售分析純。

乳酸菌培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基） 青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Sartious電子精密天平 北京賽多利斯天平有限 公司；SW-CJ-IBU超凈工作臺 蘇州蘇凈集團；5418高速離心機 芬蘭Eppendorf公司；Orion 3 STAR pH計 美國Thermo公司；GXZ-9240 MBE鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；冷凍干燥機 德國Christ公司；TA-XT.plus質構儀 英國Stable Micro Systems 公司；TU-1810型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；HH-42水浴鍋 常州國華電器有限公司；HAAKEMARS流變儀 美國Thermo Scientific公司； CR-400色差計 日本美能達公司。

1.3 方法

1.3.1 山楂葉多糖提取

選取新鮮的山楂葉洗凈烘干后粉碎，參考Yuan Qingxia等[22]的方法，取山楂葉干粉進行熱水浸提，提取條件：溫度90 ℃、添加量40 g/L、提取時間4 h。浸提結束后4 000 r/min離心20 min，收集上清液。向上清液中加入3 倍體積無水乙醇醇沉，4 ℃放置過夜， 5 000 r/min離心10 min得沉淀物。采用蒸餾水復溶沉淀后，真空冷凍干燥得到山楂葉粗多糖。山楂葉粗多糖的純度為70.28%。

1.3.2 山楂葉多糖發(fā)酵乳制備

100 mL的鮮牛乳經(jīng)65 ℃預熱加入5%蔗糖溶解后，分別加入0%、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.2%的山楂葉多糖，在95 ℃巴氏殺菌10 min，待冷卻到室溫后，分別接種1‰的保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、鼠李糖乳桿菌復合菌粉，在42 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵6 h，冷卻后放入4 ℃冰箱后熟24 h制得山楂葉多糖益生菌發(fā)酵乳[23]，以不添加山楂葉多糖的樣品為對照組。

1.3.3 乳酸菌活菌數(shù)測定

將加入不同比例山楂葉多糖的發(fā)酵乳，采用MRS平板計數(shù)法進行乳酸菌活菌數(shù)的測定[13]。

1.3.4 持水力測定

稱取50 mL離心管的質量記為M0，將加入10 mL山楂葉多糖發(fā)酵乳的離心管質量記為M1。經(jīng)3 000 r/min離心10 min的樣品靜置10 min后棄去上清液，稱量質量記為M2，平行測定3 次取平均值。持水力計算如式（1）所示：

1.3.5 酸度測定

pH值測定：采用精密pH計測定。

滴定酸度測定：取冷卻后熟后的添加不同比例山楂葉多糖發(fā)酵乳樣品，分別取10 mL發(fā)酵乳樣品于250 mL錐形瓶中，加入20 mL蒸餾水混勻，再加入適量酚酞指示劑，以0.1 mol/L的氫氧化鈉標準溶液滴定至微紅色，且30 s內不退色。記錄消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，乘以10即為樣品的滴定酸度（吉爾涅爾度）[24]。

1.3.6 色澤測定

采用CR-400色差計測定發(fā)酵乳的L*值、a*值和b*值[25]。采用標準比色板進行校正，標準比色板為L*=97.22、a*=－0.14、b*=1.82。其中L*表示亮度值， a*表示紅度值，b*表示黃度值。

1.3.7 質構測定

參考Bedani等[26]方法，略有改進。采用質構儀選擇質地剖面分析測試模式和P/0.5探頭對發(fā)酵乳的凝膠結構進行測定。速率分為測前2.0 mm/s、測中1.0 mm/s和測后2.0 mm/s；下壓間隔時間為1 s；最小觸發(fā)力為0.3 N。

1.3.8 儲能模量和損失模量測定

采用HAAKEMARS流變儀測定發(fā)酵乳的儲能模量和損失模量[27-28]。使用50 mm實心定轉子的同心圓筒，將少量經(jīng)攪拌的發(fā)酵乳樣品置于流變儀上進行測定，測定條件為溫度5 ℃，縫隙1 mm，固定頻率（0.1～20 Hz）。

1.3.9 DPPH自由基清除能力的測定

樣品均用95%乙醇溶液配制成質量濃度為0.11 g/mL溶液，向2 mL樣品溶液中加入2 mL 0.16 mmol/L DPPH溶液（溶解于95%乙醇溶液），于25 ℃水浴加熱30 min后，在517 nm波長處測得試樣吸光度（Ai）。同時以2 mL蒸餾水代替上述體系中2 mL樣品測得空白吸光度（A0）。同時以2 mL 95%乙醇溶液代替上述體系中2 mL DPPH-乙醇溶液。測得樣品本底吸光度（Aj），其中Ai和Aj每個樣品質量濃度做3 個平行，取平均值。 按式（2）計算清除率[29]：

1.3.10 羥自由基清除能力的測定

樣品均用95%乙醇溶液配制成質量濃度為0.11 g/mL溶液，向4 mL樣品溶液中加入8.8 mmol/L H2O2溶液、9 mmol/L FeSO4溶液和9 mmol/L水楊酸溶液各0.5 mL，混勻，37 ℃水浴加熱30 min，于510 nm波長處測定樣品吸光度（Ai），將體系中的樣品溶液改為加入4 mL蒸餾水，測得空白對照吸光度（A0），將加入0.5 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液代替為0.5 mL蒸餾水時，測得樣品本底吸光度（Aj），其中Ai和Aj每個質量樣品濃度做3 個平行，按式（3）計算羥自由基清除率[30]：

1.3.11 Fe3＋還原能力的測定

樣品均用95%乙醇溶液配制成質量濃度為0.11 g/mL 溶液，向2 mL樣品溶液中加入1%的鐵氰化鉀溶液和0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）各2 mL，于50 ℃保溫20 min后加入10%三氯乙酸溶液2 mL，3 000 r/min混合離心10 min后取上清液2 mL，加入2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%三氯化鐵溶液，室溫反應10 min后，測定其在700 nm波長處的吸光度[31]。每個樣品做3 個平行。

1.3.12 發(fā)酵乳感官評定

選取20 位有發(fā)酵乳感官評價經(jīng)驗的食品專業(yè)教師和同學，從色澤、組織狀態(tài)、風味、口感和風味等方面，對添加不同比例山楂葉多糖的發(fā)酵乳進行感官評定，根據(jù) 表1所示的評分標準進行評分，滿分為100 分，感官評分為20 人打分的平均分值[32]。

表 1 發(fā)酵乳感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented milk

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行分析，所有實驗重復3 次，結果以f s表示，顯著性分析采用Duncan檢驗。

2 結果與分析

2.1 山楂葉多糖對發(fā)酵乳中乳酸菌活菌數(shù)的影響

表 2 山楂葉多糖對發(fā)酵中乳酸菌活菌數(shù)的影響Table 2 Effects of HLP on viable cell count of fermented milk

由表2可知，隨著山楂葉多糖添加量的增加，益生乳酸菌的活菌數(shù)量呈遞增趨勢，從4.42h 108CFU/mL增加至4.51h 109CFU/mL，且當山楂葉多糖添加量高于0.12%時，其益生菌活菌數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05），至添加量為0.16%時，乳酸菌活菌數(shù)達到109CFU/mL以上，說明山楂葉多糖可以有效促進益生乳酸菌的增殖，提高發(fā)酵乳中益生乳酸菌的數(shù)量。已有研究報道天然植物多糖可以作為益生元，促進益生乳酸菌的生長[33-34]，而益生乳酸菌可以通過代謝產(chǎn)生維生素、多肽等功能成分，提高發(fā)酵乳的營養(yǎng)價值，還可抑制有害微生物的生長。因此，在發(fā)酵乳中添加山楂葉多糖可以增加益生乳酸菌的數(shù)量，提高發(fā)酵乳的益生效果。

2.2 山楂葉多糖對發(fā)酵乳持水力的影響

圖 1 山楂葉多糖對發(fā)酵乳持水力的影響Fig. 1 Effect of HLP on water-holding capacity of fermented milk

由圖1可知，隨著山楂葉多糖添加量的增加，發(fā)酵乳的持水力呈先升高后降低的變化，不同山楂葉多糖添加量發(fā)酵乳的持水力均顯著高于對照組（P＜0.05），且當山楂葉多糖添加量為0.12%時，發(fā)酵乳的持水力達到最高為60.24%。發(fā)酵乳由于其含有大量的酪蛋白，蛋白分子之間可以形成網(wǎng)狀空間膠體結構，該結構可以容納水分和其他小分子物質。當添加一定量多糖后，可能進一步促進了酪蛋白之間的相互作用，因此提高了持水性[35-36]。但是當山楂葉多糖添加量高于0.16%后，可能由于過量的多糖破壞了蛋白質之間的互相聚集作用，導致乳清析出增多，從而導致持水力下降[37]。本研究與已研究報道的松茸多糖和紅棗多糖的研究結果基本一致，添加適量的天然多糖可以改善發(fā)酵乳的持水性，改善其組織狀態(tài)，提高發(fā)酵乳的品質。

2.3 山楂葉多糖對發(fā)酵乳酸度的影響

圖 2 山楂葉多糖對發(fā)酵乳滴定酸度的影響Fig. 2 Effect of HLP on titratable acidity of fermented milk

由圖2可知，隨著山楂葉多糖添加量的增加，發(fā)酵乳的滴定酸度呈持續(xù)升高的趨勢，且不同山楂葉多糖添加量發(fā)酵乳的滴定酸度均顯著高于對照組（P＜0.05）。由于山楂葉多糖的添加可以促進發(fā)酵乳中益生乳酸菌的生長，而乳酸菌的生長過程中會利用多糖類物質進行發(fā)酵產(chǎn)生乳酸及其他有機酸類[38]。

圖 3 山楂葉多糖對發(fā)酵乳pH值的影響Fig. 3 Effect of HLP on pH value of fermented milk

由圖3可知，隨著山楂葉多糖添加量的增加，發(fā)酵乳的pH值呈持續(xù)降低的趨勢，且不同山楂葉多糖添加量發(fā)酵乳的pH值均顯著低于對照組（P＜0.05），這與滴定酸度的測定結果一致。發(fā)酵乳pH值的降低主要由乳酸菌生長發(fā)酵糖類物質產(chǎn)生有機酸引起的[39]，pH值不僅與發(fā)酵乳的風味和凝膠特性相關，還影響到食品安全[40]。適當降低發(fā)酵乳的pH值，可以改善發(fā)酵乳的風味和組織狀態(tài)，而且較低的pH值可以抑制有害微生物的生長，提高發(fā)酵乳貯藏期間安全性。

2.4 山楂葉多糖對發(fā)酵乳色澤的影響

由表3可知，與對照組相比，隨著山楂葉多糖添加量的增加，發(fā)酵乳的L*值逐漸降低，而a*值和b*值卻逐漸升高，且添加不同質量分數(shù)山楂葉多糖發(fā)酵乳的L*、a*和b*值與對照組之間具有顯著性差異（P＜0.05）。這主要因為山楂葉多糖本身具有褐色，多糖提取中摻雜了一些色素，而隨著添加量的增加，導致發(fā)酵乳的顏色逐漸變暗，賦予發(fā)酵乳咖啡色的色澤。

表 3 發(fā)酵乳的色澤Table 3 Effect of HLP on color parameter of fermented milk

2.5 山楂葉多糖對發(fā)酵乳質構的影響

表 4 發(fā)酵乳的質構特性Table 4 Effect of HLP on textural properties of fermented milk

由表4可知，隨著山楂葉多糖添加量的增加，發(fā)酵乳的硬度、咀嚼性、黏性和內聚性呈現(xiàn)先增大后減小的變化，除0.20%添加量組，添加山楂葉多糖組的硬度均顯著高于空白對照組（P＜0.05），當添加量為0.16%時，其硬度達到最大值204.91 g；同時發(fā)酵乳的咀嚼性和黏性隨著硬度的變化而變化，當添加量為0.16%時，其咀嚼性、黏性和內聚性均達到最大值，分別為達到139.50、119.33和0.47。當山楂葉多糖添加量超過0.20%后，其硬度、咀嚼性、黏性和內聚性均呈現(xiàn)顯著下降（P＜0.05）。

添加山楂葉多糖導致發(fā)酵乳質構發(fā)生變化，可能由于適量的多糖添加，有利于增強發(fā)酵乳的凝膠狀態(tài)，導致其內部分子間相互作用力增強，相互聚集形成的網(wǎng)狀結構更加穩(wěn)定，增強發(fā)酵乳的硬度[41]；黏性可以使發(fā)酵乳具有更黏稠的口感，在一定的范圍內，硬度和黏性高的發(fā)酵乳具有更好的口感[42]；而咀嚼性高的發(fā)酵乳會使吞咽狀態(tài)的能力需求更多，賦予發(fā)酵乳一定的黏稠口感。但是添加過量的多糖后，可能會破壞分子間的相互作用，導致形成的網(wǎng)絡結構變得不穩(wěn)定，發(fā)酵乳質構變差[43]。

2.6 山楂葉多糖對發(fā)酵乳儲能模量和損失模量影響

儲能模量G’和損失模量G”與凝膠中作用力的大小呈正相關，G’主要表示能量高的相互作用力，而G”主要反映能量低的相互作用力。此外二者主要與發(fā)酵乳中的總固形物有關，尤其是發(fā)酵乳中蛋白質的數(shù)量和類型。如圖4所示，所有的發(fā)酵乳樣品在頻率的變化下G’和G”都具有相似的變化趨勢，可能因為樣品中的總固形物含量接近，但所有發(fā)酵乳樣品的G’都明顯高于G”，這是凝膠網(wǎng)狀結構所具有的典型特征，表明發(fā)酵乳形成了弱凝膠網(wǎng)狀結構，具有黏彈性的性質[44]。添加山楂葉多糖后，發(fā)酵乳的G’和G”都發(fā)生明顯的變化，隨著山楂葉多糖添加量的增加，G’和G”呈遞增的趨勢，變化曲線逐漸高于空白對照組。G’和G”在開始階段（頻率0～1 Hz）時均快速增加，隨后才呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢，這與Sah[27]和Haque[45]等的研究結果一致。G’主要表示每個頻率變化周期貯存的能量，變高說明發(fā)酵乳體系中的相互作用力強度較高，凝膠的貯存穩(wěn)定性變好。因此，添加適量的山楂葉多糖，可有效改善發(fā)酵乳的凝膠品質。

圖 4 發(fā)酵乳G’（A）和G”（B）隨頻率變化曲線Fig. 4 Changes in storage modulus (A) and loss modulus (B) with frequency for fermented milk

2.7 山楂葉多糖對發(fā)酵乳抗氧化性的影響

圖 5 山楂葉多糖對發(fā)酵乳DPPH自由基（A）、羥自由基（B） 清除能力和Fe3＋還原能力（C）的影響Fig. 5 Effect of HLP on DPPH (A) and hydroxyl (B) free radical scavenging ability and Fe3+ reducing power (C) of fermented milk

由圖5A可知，與對照組發(fā)酵乳的DPPH自由基清除率38.4%相比，隨著山楂葉多糖添加量的增加，發(fā)酵乳的DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢，清除率最高可達到80.7%，且各處理組均顯著高于空白對照組 （P＜0.05）。結果表明添加一定量的山楂葉多糖可以有效提高發(fā)酵乳的DPPH自由基清除能力。山楂葉多糖可能作為一種供氫物質，能夠與自由基反應形成穩(wěn)定的物質，從而阻止了DPPH自由基鏈式反應[46]。

由圖5B可知，與對照組發(fā)酵乳的羥自由基清除率45.6%相比，隨著山楂葉多糖添加量的增加，發(fā)酵乳清除羥自由基的能力呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，清除率最高可達到81.6%，且各處理組和空白對照組之間羥自由基清除率具有顯著差異（P＜0.05）。說明添加一定量的山楂葉多糖可以有效提高發(fā)酵乳的羥自由基清除能力。山楂葉多糖可能是一種良好的電子供體，提供給羥自由基后將其還原為OH－，從而導致羥自由基被清除。

由圖5C可知，隨著山楂葉多糖添加量的增加，發(fā)酵乳對Fe3＋的還原能力不斷提高，且添加不同量山楂葉多糖的發(fā)酵乳的Fe3＋還原能力均顯著高于對照組 （P＜0.05）?？瞻讓φ战M吸光度僅為0.24，而添加山楂葉多糖的發(fā)酵乳吸光度最高達到0.56，吸光度越高，則說明發(fā)酵乳將更多的Fe3＋還原成為Fe2＋。山楂葉多糖可能為一種良好的電子供體，所提供的電子不僅可以使Fe3＋還原為Fe2＋，還可能直接與自由基物質反應生成更穩(wěn)定的物質。因此山楂葉多糖的添加可以在一定程度上提高發(fā)酵乳的抗氧化能力。

2.8 山楂葉多糖對發(fā)酵乳感官品質的影響

表 5 發(fā)酵乳的感官評分Table 5 Effect of HLP on sensory evaluation of fermented milk

由表5可知，當山楂葉多糖在0.04%～0.16%范圍時，隨添加量的增加，發(fā)酵乳的感官評分呈升高趨勢，且發(fā)酵乳的感官評價分數(shù)高于空白對照組，當山楂葉多糖添加量為0.16%時，發(fā)酵乳的感官評分最高，說明添加山楂葉多糖可以改善發(fā)酵乳的色澤、組織狀態(tài)、風味和口感。但當山楂葉多糖添加量為0.20%時，感官評分開始下降且低于空白對照組。可能由于添加過量的山楂葉多糖會部分破壞發(fā)酵乳的組織凝膠結構，導致乳清析出過多，且發(fā)酵酸度過高，影響發(fā)酵乳的感官品質。因此，適量添加量的山楂葉多糖可以增加發(fā)酵乳的風味，改善發(fā)酵乳的組織狀態(tài)，提高發(fā)酵乳的口感。

3 結 論

添加山楂葉多糖可以提高發(fā)酵乳中益生乳酸菌的活菌數(shù)、滴定酸度、持水力和抗氧化活性以及改善發(fā)酵乳色澤、儲能模量、損失模量和質構特性等，當山楂葉多糖添加量為0.16%時，其硬度、黏性和咀嚼性達到最大。添加山楂葉多糖可以有效改善發(fā)酵乳的組織狀態(tài)，增強發(fā)酵乳的風味，提高發(fā)酵乳的品質。