魏婧琦，李冬男，孟憲軍

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpca Elliot），薔薇屬，又叫不老梅[1]、野櫻莓，其含有極高含量花色苷、酚酸、類(lèi)黃酮等物質(zhì)，具有較高的抗氧化能力，對(duì)人體健康十分有益，在歐洲也被稱(chēng)作“超級(jí)梅”，其果實(shí)形狀渾圓，呈黑紫色，味道酸甜并帶有澀味，原產(chǎn)于北美，我國(guó)現(xiàn)已廣泛種植。黑果腺肋花楸中多酚類(lèi)物質(zhì)十分豐富，其中的山柰酚、咖啡酸、阿魏酸、槲皮素等物質(zhì)已被證實(shí)有抗流感、抗細(xì)胞毒性的作用[2-3]。黑果腺肋花楸多酚中花色苷占比為25%，僅次于接骨木[4]和越橘[5]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者致力于黑果腺肋花楸花色苷的提取純化[6-8]，提取量可達(dá)361 mg/100 g。眾所周知，花色苷是植物中最常見(jiàn)的色素之一，具有很多生理功能，比如抑制DNA的氧化損傷，降低膽固醇[9]和心血管疾病的發(fā)病率[10]，對(duì)胰島素分泌有促進(jìn)作用[11]。果膠作為天然可溶性膳食纖維[12]，除了在食品加工中作為增稠劑與穩(wěn)定劑外，還具有降低血膽固醇水平、影響葡萄糖代謝[13]、降低結(jié)腸癌[14]風(fēng)險(xiǎn)等作用。

花色苷主要位于植物細(xì)胞的液泡中，在加工過(guò)程中植物組織遭到破壞，細(xì)胞壁和液泡成分相互接觸，會(huì)發(fā)生分子間相互作用[15]。進(jìn)而影響花色苷的提取率，生物利用度，顏色特性和化學(xué)穩(wěn)定性[16]。研究發(fā)現(xiàn)，果膠與花色苷結(jié)合可防止水溶性環(huán)境中花色苷的色素沉淀，增強(qiáng)花色苷的穩(wěn)定性[17-18]，延長(zhǎng)其半衰期[19-21]，降低花色苷在小腸中的損耗[22]。結(jié)合親和力越大，對(duì)花色苷在胃釋放或外部降解條件下的保護(hù)作用越大[23]。因此，果膠與花色苷的相互作用可能會(huì)減緩花色苷在人體內(nèi)的降解，提高其在結(jié)腸環(huán)境的代謝能力。

現(xiàn)階段關(guān)于果膠和花色苷結(jié)合物的研究主要集中在探討結(jié)合物的穩(wěn)定性及結(jié)構(gòu)變化[24]，但還缺少各類(lèi)因素對(duì)結(jié)合效果及其結(jié)合狀況的研究。

為了探索花色苷與果膠相互結(jié)合作用及其作用特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用超濾離心法測(cè)定花色苷與果膠的結(jié)合率，超濾離心法是現(xiàn)階段濃縮、分離樣品溶液的常用手段，通過(guò)離心作用力使超濾離心管中待分離樣品快速通過(guò)管壁的中空纖維膜，從而使不同分子質(zhì)量的物質(zhì)得到分離。本實(shí)驗(yàn)中果膠屬于大分子物質(zhì)，通過(guò)對(duì)結(jié)合物的超濾離心，即可得出花色苷與果膠的結(jié)合率。

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析黑果腺肋花楸中不同花色苷與果膠的結(jié)合情況，并對(duì)結(jié)合后產(chǎn)物的穩(wěn)定性和抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定分析，為進(jìn)一步探究花色苷與果膠相互作用提供理論依據(jù)，為保護(hù)相關(guān)產(chǎn)品中的花色苷成分提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸（“富康源1號(hào)”）于2017年8月采自遼寧省海城市，采收當(dāng)天運(yùn)至沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，置于－80 ℃冰箱中貯藏。

藍(lán)莓果膠（食品級(jí)） 廣州西楚生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、鹽酸、氯化鉀、無(wú)水乙酸鈉、水楊酸（均為分析純），VC 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純） 西隴科學(xué)股份有限公司；矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品 南京源植生物有限公司；胃蛋白酶（800～1 000 U/mg）、胰蛋白酶（1∶250）、脫氧膽酸鹽 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2,2’-聯(lián)氨-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽(yáng)離子自由基試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司；Fe3＋還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP） 試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠； BT-100B型數(shù)顯恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司； IT09A12型磁力攪拌器 上海一恒儀器有限公司；FA2004型電子萬(wàn)分之一天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；MIX-28型迷你渦旋振蕩器 群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；5804R型高速冷凍離心機(jī) 艾本德生命科學(xué)公司；30kDa超濾離心管 美國(guó)默克密理博公司；PB-10型pH計(jì) 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；CM-10FL型真空冷凍濃縮系統(tǒng) 美國(guó)Labconco公司；1290 Infinity II HPLC儀 美國(guó)安捷倫公司；130701A型酶標(biāo)儀 美國(guó)博騰儀器有限公司

1.3 方法

1.3.1 花色苷與果膠結(jié)合物的制備

花色苷的提取純化參照文獻(xiàn)[6-8]的方法進(jìn)行，并稍作改動(dòng)。

將黑果腺肋花揪在常溫解凍后，破碎勻漿，置于燒杯中，按照料液比為1∶30（g/mL）加入60%的酸化乙醇（pH 2.0）溶液，攪拌后用保鮮膜封口，放置于55 ℃水浴鍋中浸提120 min。將提取液抽濾、減壓蒸餾后得到花色苷濃縮液。

花色苷濃縮液經(jīng)NKA-9樹(shù)脂純化后，進(jìn)行冷凍干燥，得到黑果腺肋花楸花色苷粉末。

用緩沖溶液將花色苷粉末溶解（4 mg/mL）后加入到相同體積不同質(zhì)量濃度的果膠溶液中，用磁力攪拌器將兩者混合均勻，置于4 ℃避光孵育10 h。

1.3.2 花色苷含量測(cè)定

采用酶標(biāo)儀法，參照王月華等[25]的方法，并稍作 改動(dòng)。

準(zhǔn)確量取2 份0.1 mL樣品分別與0.9 mL氯化鉀緩沖液（pH 1.0）和0.9 mL乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）混合后，置于室溫平衡10 min。分別在520 nm和700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)混合物的吸光度，蒸餾水為空白?；ㄉ蘸恳悦可龢悠分惺杠?chē)菊-3-葡萄糖苷當(dāng)量表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值?；ㄉ蘸堪词剑?）、（2）計(jì)算：

式中：mw為矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量（449.2）；DF為樣品的稀釋倍數(shù)；ε為矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)（269 00 L/（molg cm））；L為光程（1 cm）。

1.3.3 結(jié)合率測(cè)定

參照Lin Zhuangsheng等[26]的方法，并稍作改動(dòng)。量取2 mL的結(jié)合物樣品于超濾離心管（30 kDa）中，4 ℃、14 000h g離心20 min，取管下部溶液測(cè)定花色苷含量。結(jié)合率按式（3）計(jì)算：

式中：Ci為花色苷與果膠結(jié)合物的花色苷初始質(zhì)量濃度/（mg/mL）；Cj為離心后管下部溶液的花色苷質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

選取pH值、花色苷與果膠添加比例、金屬離子濃度、糖類(lèi)添加量4 個(gè)因素，改變單一因素觀察黑果腺肋花楸花色苷與果膠結(jié)合率的變化，單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，每個(gè)單因素試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

表 1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Levels of independent variables used for one-factor-at-a-time design

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合單因素試驗(yàn)，選定pH值與花色苷與果膠添加比例為影響結(jié)合率的主要因素，每個(gè)因素選擇3 個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)（表2）。

表 2 正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Codes and levels of independent variables used for orthogonal array design

1.3.6 HPLC分析黑果腺肋花楸花色苷與果膠的相互作用

準(zhǔn)確抽取1 mL結(jié)合樣品，與2 mL甲醇充分混合，經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾，除去沉淀（果膠及與果膠結(jié)合的花色苷）后，置于－80 ℃環(huán)境中備用分析。

根據(jù)Bohkyung等[6]的方法，采用HPLC法測(cè)定花色苷的種類(lèi)組成的方法。HPLC測(cè)定條件：Diamonsil C18色譜柱（250 mmh 4.6 mm，5 μm）；柱溫20 ℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液；流動(dòng)相B為乙腈；流速0.7 mL/min；梯度洗脫程序：0～40 min，0%～40% B；40～45 min，40%～45% B；45～52 min，0% B。

1.3.7 花色苷穩(wěn)定性測(cè)定

1.3.7.1 熱處理對(duì)黑果腺肋花楸花色苷與果膠結(jié)合產(chǎn)物中花色苷穩(wěn)定性的影響

將結(jié)合樣品溶液分別置于70 ℃和90 ℃（恒溫水?。l件下，避光處理5 h，同一溫度下每隔1 h取樣，于室溫下測(cè)定花色苷含量，以相同質(zhì)量濃度的花色苷溶液作為對(duì)照，計(jì)算花色苷保留率。

1.3.7.2 體外模擬消化對(duì)黑果腺肋花楸花色苷與果膠結(jié)合產(chǎn)物中花色苷穩(wěn)定性的影響

模擬體外消化過(guò)程參照王月華[25]和劉翼翔[27]等的方法，并稍作改動(dòng)。

胃消化：量取2 mL結(jié)合樣品，用10 mL生理鹽水（0.9% NaCl）稀釋后，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)混合溶液pH值至2，隨后加入4.5 mg胃蛋白酶，混合后在37 ℃避光振蕩培養(yǎng)2 h。

腸消化：向胃消化后的樣品中加入NaCO3溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5，再加入胰蛋白酶（2 mg/mL）和脫氧膽酸鹽（3.4 mg/mL），充分混合后37 ℃避光振蕩培養(yǎng)2 h。

2 組消化過(guò)程分別在消化30、60、90、120 min時(shí)取樣，并將樣品迅速降溫及酸化至pH 2，測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)花色苷含量，計(jì)算其保留率。

1.3.8 抗氧化活性測(cè)定

1.3.8.1 FRAP測(cè)定

參照相關(guān)文獻(xiàn)[6,28]方法。配制反應(yīng)液：1）空白對(duì)照組：180 μL FRAP工作液＋5 μL蒸餾水；2）標(biāo)準(zhǔn)曲線組：180 μL FRAP工作液＋5 μL各濃度FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液；3）測(cè)定組：180 μL FRAP工作液＋5 μL樣品。振蕩混勻，在37 ℃反應(yīng)5 min后測(cè)定593 nm波長(zhǎng)處吸光度，重復(fù)3 次取平均值，以蒸餾水作為空白對(duì)照，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2.643 2x－0.392 5（R2=0.993 7），y為樣品對(duì)應(yīng)的吸光度；x為FeSO4標(biāo)準(zhǔn)品濃度/（mmol/L）。

1.3.8.2 羥自由基清除能力測(cè)定

將5 0 μ L 樣 品 溶 液，依 次 加 入5 0 μ L F e S O4（6 mmol/L）、100 μL H2O2（6 mmol/L）充分搖勻后室溫放置10 min；加入50 μL水楊酸（6 mmol/L乙醇溶解），溶解后搖勻室溫放置30 min，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，重復(fù)3 次取平均值，以蒸餾水作為空白對(duì)照，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。羥自由基清除率按式（4）計(jì)算：

式中：A0為空白組于波長(zhǎng)510 nm處吸光度；Ai為樣品于波長(zhǎng)510 nm處吸光度。

1.3.8.3 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定

參照Urszula等[29]的方法略有修改。配制反應(yīng)液：1）空白對(duì)照組：200 μL ABTS工作液＋10 μL蒸餾水；2）標(biāo)準(zhǔn)曲線組：200 μL ABTS工作液＋10 μL各濃度Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液；3）測(cè)定組：200 μL ABTS工作液＋10 μL樣品。振蕩混勻，在37 ℃反應(yīng)5 min后測(cè)定734 nm處吸光度，重復(fù)3 次取平均值，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=－0.760 6x＋1.039 8（R2=0.986 8），y為樣品對(duì)應(yīng)的吸光度，x為T(mén)rolox標(biāo)準(zhǔn)品濃度/（mmol/L）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用Origin 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理繪圖，用SPSS 19.0軟件分析顯著性，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 pH值對(duì)結(jié)合率的影響

圖 1 pH值對(duì)結(jié)合率的影響Fig. 1 Effect of environmental pH on binding rate

如圖1所示，pH值對(duì)果膠與花色苷的結(jié)合具有顯著影響，這與Lin Zhuangsheng等[26]的結(jié)論一致，花色苷陽(yáng)離子和游離果膠羧基之間的離子相互作用可能是結(jié)合的主要機(jī)制。

隨著pH值的升高，黑果腺肋花楸花色苷與果膠的結(jié)合率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)結(jié)合pH值為3時(shí)結(jié)合率最高為80.52%（P＜0.05）。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于酸性環(huán)境中，部分果膠發(fā)生去質(zhì)子化，形成ü COO－，而花色苷分子大多以花色苷陽(yáng)離子形式存在，果膠游離的羧基與帶正電的花色苷陽(yáng)離子發(fā)生離子交聯(lián)，而溶液中的H＋與花色苷陽(yáng)離子存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，使得結(jié)合率在pH 3.0時(shí)到達(dá)結(jié)合峰值。

2.1.2 花色苷與果膠添加比例對(duì)結(jié)合率的影響

圖 2 花色苷與果膠添加比例對(duì)結(jié)合率的影響Fig. 2 Effect of ratio of anthocyanins to pectin on binding rate

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中始終保持花色苷質(zhì)量濃度（4 mg/mL） 不變，增加果膠添加量，結(jié)果如圖2所示，果膠出現(xiàn)從飽和狀態(tài)至非飽和狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，花色苷與果膠添加比例為1∶2.5時(shí)結(jié)合率達(dá)到87.96%（P＜0.05）的峰值水平。由于花色苷與果膠添加比例為1∶2與1∶2.5時(shí)結(jié)合率差異變化不大，為降低成本，節(jié)約果膠用量，選擇花色苷與果膠添加比例為1∶2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 金屬離子濃度對(duì)結(jié)合率的影響

圖 3 金屬離子濃度對(duì)結(jié)合率的影響Fig. 3 Effect of metal ions on bonding rate

如圖3所示，隨著金屬離子濃度的增加，Ca2＋、Mg2＋結(jié)合率曲線均呈現(xiàn)逐步降低的趨勢(shì)，但Mg2＋結(jié)合率曲線降低趨勢(shì)較?。≒＞0.05）。Ca2＋與結(jié)合率呈負(fù)相關(guān)。 Ca2＋、Mg2＋同時(shí)存在于酸性條件下，金屬離子與羧基之間存在一定的相互作用[30]，果膠離解的游離羧基與陽(yáng)離子的交聯(lián)順序?yàn)镃a2＋＞H＋＞Mg2＋，所以Ca2＋的存在阻礙了花色苷與果膠的結(jié)合。所以在黑果腺肋花楸的食品工業(yè)生產(chǎn)中，以果膠作為增稠劑穩(wěn)定劑的情況下，要嚴(yán)格控制生產(chǎn)用水的硬度，尤其是Ca2＋的含量。

2.1.4 糖類(lèi)添加量對(duì)結(jié)合率的影響

圖 4 糖類(lèi)添加量對(duì)結(jié)合率的影響Fig. 4 Effect of carbohydrates on bonding rate

糖類(lèi)會(huì)對(duì)高甲氧基果膠體系的凝膠強(qiáng)度產(chǎn)生影響，所以分別選取果糖、葡萄糖、蔗糖研究糖類(lèi)對(duì)于結(jié)合率的影響。如圖4所示，隨著糖添加量的增加，結(jié)合率無(wú)顯著差異（P＞0.05）。表明糖類(lèi)添加對(duì)于花色苷與果膠的結(jié)合率無(wú)顯著影響。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表 3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Orthogonal array design with experimental results

表 4 方差分析Table 4 Analysis of variance of the effect of various factors on binding rate

由表3可知，極差值RA為11.64，RB為4.33，說(shuō)明pH值（A）對(duì)于結(jié)合率的影響要高于花色苷與果膠添加比例，最佳的結(jié)合條件組合為A2B2，即在pH 3、花色苷與果膠添加比例為1∶2.0時(shí)進(jìn)行結(jié)合率最高（78.77%）。由表4方差分析可知，F(xiàn)A=128.020 1＞F0.05（2,2），F(xiàn)B=20.663 0＞F0.1（2,2），說(shuō)明兩因素均對(duì)結(jié)合率存在影響，并且pH值對(duì)于結(jié)合率的影響更顯著。經(jīng)驗(yàn)證最優(yōu)條件為pH 3、花色苷與果膠添加比例為1∶2.0。

2.3 HPLC分析黑果腺肋花楸花色苷與果膠的結(jié)合情況

圖 5 黑果腺肋花楸花色苷色譜圖Fig. 5 HPLC profile of anthocyanins from A. melanocarpa extracts

如圖5所示，共出現(xiàn)4 個(gè)主體峰[6,31]，依次為矢車(chē)菊-3-半乳糖苷（55.3%）、矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷（6.1%）、矢車(chē)菊-3-阿拉伯糖苷（31.4%）、矢車(chē)菊-3-木糖苷（7.0%），這4 種花色苷占整體花色苷的99%以上。

圖 6 黑果腺肋花楸花色苷與果膠相互作用HPLC分析Fig. 6 HPLC analysis of the interaction of anthocyanins with pectin

在正交試驗(yàn)所得的最佳結(jié)合條件（pH 3、花色苷質(zhì)量濃度4 mg/mL、果膠質(zhì)量濃度8 mg/mL）下制備結(jié)合物進(jìn)行結(jié)合情況的HPLC分析檢測(cè)，根據(jù)峰面積的減少量計(jì)算結(jié)合率，以此衡量結(jié)合能力。由圖6可知，由于花色苷結(jié)構(gòu)上的差異，造成了各類(lèi)花色苷與果膠結(jié)合效果的不同。由于1號(hào)峰（矢車(chē)菊-3-半乳糖苷）在黑果腺肋花楸花色苷中占有較大比重，總花色苷結(jié)合率與1號(hào)峰結(jié)合率差異不顯著（P＞0.05）。前3 個(gè)峰（矢車(chē)菊-3-半乳糖苷、矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷、矢車(chē)菊-3-阿拉伯糖苷）的結(jié)合率分別為58.05%、57.66%和58.41%，差異不 顯著（P＞0.05），全部高于4號(hào)峰（矢車(chē)菊-3-木糖苷）的結(jié)合率（51.34%）。

在花色苷與果膠的相互作用中，羥基的存在可以增強(qiáng)兩者結(jié)合作用，而甲氧基的存在則會(huì)對(duì)結(jié)合產(chǎn)生負(fù)面影響[26]。黑果腺肋花楸花色苷的糖基中，半乳糖與葡萄糖同為六碳糖，所有相較于只有5 個(gè)碳的阿拉伯糖苷和木糖苷具有更好的結(jié)合效果。而阿拉伯糖與木糖苷兩者只存在構(gòu)型上的差異，阿拉伯糖屬于L（＋）構(gòu)型，木糖苷屬于D（＋）構(gòu)型。因此，可以推測(cè)花色苷與果膠的結(jié)合效果不僅與花色苷分子上羥基和甲氧基的數(shù)量有關(guān)，還可能受到花色苷分子糖基構(gòu)型的影響。

2.4 黑果腺肋花楸花色苷與果膠結(jié)合產(chǎn)物的穩(wěn)定性

2.4.1 熱處理對(duì)黑果腺肋花楸花色苷與果膠結(jié)合產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響

圖 7 溫度對(duì)花色苷與果膠結(jié)合物穩(wěn)定性的影響Fig. 7 Effect of temperature on the stability of anthocyanin and pectin conjugate

將花色苷與果膠在pH 3、果膠質(zhì)量濃度8 mg/mL的條件下制備結(jié)合物，進(jìn)行熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。隨著處理溫度升高、處理時(shí)間延長(zhǎng)，各樣品溶液顏色均發(fā)生了明顯變化。在70 ℃條件下，隨著溫度的升高，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組溶液顏色逐漸由深紫紅色向淺紫色轉(zhuǎn)變。在90 ℃條件下，顏色轉(zhuǎn)變迅速加快，從深紫紅色褪至橘黃色，這是由于花色苷在熱環(huán)境下發(fā)生水解或去糖基開(kāi)環(huán)反應(yīng)，降解為酚酸和醛類(lèi)[32]。降解速度隨溫度的升高而加快[33]。

由圖7可知，隨著溫度和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各樣品溶液中的花色苷保留率都呈下降趨勢(shì)，并且90 ℃條件下花色苷降解速度明顯高于70 ℃，實(shí)驗(yàn)組的花色苷保留率均高于對(duì)照組。說(shuō)明果膠對(duì)花色苷分子在高溫條件下的快速降解具有抑制作用。

2.4.2 體外模擬消化對(duì)黑果腺肋花楸花色苷與果膠結(jié)合產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響

圖 8 體外模擬胃腸消化對(duì)花色苷與果膠結(jié)合物穩(wěn)定性的影響Fig. 8 Effect of in vitro simulated gastrointestinal digestion on the stability of anthocyanin and pectin conjugate

將花色苷與果膠在pH 3、果膠質(zhì)量濃度8 mg/mL的條件下制備結(jié)合物，進(jìn)行體外模擬消化實(shí)驗(yàn)。在pH值為2的條件下，花色苷分子以紅色黃烊鹽陽(yáng)離子形式穩(wěn)定存在，隨著pH值的升高，花色苷分子會(huì)從紅色黃烊鹽離子形式轉(zhuǎn)化為無(wú)色的甲醇假堿式，接著經(jīng)過(guò)查爾酮式后分解成褐色物質(zhì)[34]。所以花色苷在經(jīng)過(guò)胃腸道消化的過(guò)程中，胃消化階段幾乎不會(huì)對(duì)花色苷造成影響。經(jīng)過(guò)胃消化過(guò)后，環(huán)境pH值驟升至7.5，花色苷含量也驟減，并在2 h的腸消化階段內(nèi)，從深紫紅色、淺紫色褪至黃褐色。

由圖8可以看出，添加了果膠的黑果腺肋花楸花色苷溶液（實(shí)驗(yàn)組）的保留率高于不添加果膠的果腺肋花楸花色苷溶液（對(duì)照組），與熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)規(guī)律一致，但其對(duì)花色苷的影響程度沒(méi)有溫度對(duì)花色苷的影響程度大?？赡苁怯捎趐H值對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響較大。

2.5 黑果腺肋花楸花色苷與果膠結(jié)合產(chǎn)物的抗氧化活性

2.5.1 羥自由基清除能力比較分析

圖 9 花色苷與花色苷果膠結(jié)合物羥自由基清除能力比較Fig. 9 Comparison of hydroxyl radial scavenging ability of anthocyanins with that of anthocyanins and pectin conjugate

分別測(cè)定相同質(zhì)量濃度（4 mg/mL）下花色苷溶液、花色苷果膠結(jié)合溶液的羥自由基清除能力，結(jié)果如圖9所示。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，得出VC羥自由基清除標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.263 5x＋0.061 8，R2=0.949 9，x為VC標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度/（mg/mL），y為羥自由基清除率。由圖9可知，花色苷溶液與結(jié)合物的羥自由基清除率分別為55.24%和45.1%，相當(dāng)于1.86 mg和1.48 mg VC當(dāng)量，且兩者差異顯著（P＜0.05）。說(shuō)明果膠與花色苷的結(jié)合使花色苷的羥自由基清除能力減弱，但結(jié)合物仍然具備1.48 mg VC當(dāng)量的羥自由基清除能力。

2.5.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力比較分析

圖 10 花色苷與花色苷果膠結(jié)合物ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力比較Fig. 10 Comparison of ABTS radical cation scavenging ability of anthocyanins with that of anthocyanins and pectin conjugate

分別測(cè)定相同質(zhì)量濃度（4 mg/mL）下花色苷溶液、花色苷果膠結(jié)合溶液ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力，結(jié)果見(jiàn)圖10。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，得出VC清除ABTS陽(yáng)離子自由基標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=15.85x－0.276 6，R2=0.99，x為VC質(zhì)量濃度/（mg/mL），y為T(mén)rolox標(biāo)準(zhǔn)品 濃度/（mmol/L）。由圖10可知，花色苷溶液與結(jié)合物的ABTS陽(yáng)離子自由基清除效果相當(dāng)于2.50 mmol/L和1.33 mmol/L的Trolox當(dāng)量，相當(dāng)于0.17 mg和0.1 mg的VC當(dāng)量，且兩者差距顯著（P＜0.05）。說(shuō)明花色苷與果膠結(jié)合后對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力產(chǎn)生了一定的負(fù)面影響，但結(jié)合物仍然具有0.1 mg VC當(dāng)量的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力。

2.5.3 FRAP比較分析

圖 11 花色苷與花色苷果膠結(jié)合物對(duì)FRAP比較Fig. 11 Comparison of Fe3+ reducing ability of anthocyanins with anthocyanins and pectin conjugate

分別測(cè)定相同質(zhì)量濃度（4 mg/mL）下花色苷溶液、花色苷果膠結(jié)合溶液的FRAP，結(jié)果見(jiàn)圖11。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，得出VC的FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=7.421x－0.130 1，R2=0.989，x為VC質(zhì)量濃度/（mg/mL），y為Fe2＋標(biāo)準(zhǔn)品濃度/（mmol/L）。由圖11可知，花色苷溶液與結(jié)合物分別能還原1.50 mol/L和0.28 mol/L Fe2＋， 相當(dāng)于0.22 mg和0.06 mg VC當(dāng)量，且兩者差異顯 著（P＜0.05）。說(shuō)明果膠與花色苷的結(jié)合對(duì)花色苷的FRAP產(chǎn)生了負(fù)面影響，但結(jié)合物仍然具有0.06 mg VC當(dāng)量的Fe3＋還原能力。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)比較pH值、花色苷與果膠添加比例、金屬離子濃度和糖添加量對(duì)結(jié)合率的影響，結(jié)果表明，pH值和花色苷與果膠添加比例對(duì)黑果腺肋花楸花色苷與果膠的結(jié)合效果影響顯著；在pH值為3，花色苷與果膠添加比例為1∶2的條件下，結(jié)合率可達(dá)78.77%；Mg2＋和糖類(lèi)物質(zhì)對(duì)結(jié)合效果影響不顯著，Ca2＋的添加則會(huì)抑制結(jié)合作用。

結(jié)果表明，不同類(lèi)型的花色苷與果膠具有不同的結(jié)合效果，結(jié)合效果不僅與花色苷分子上羥基和甲氧基的數(shù)量有關(guān)，還可能受到花色苷分子糖基構(gòu)型的影響。果膠可以提高花色苷在體內(nèi)以特殊結(jié)構(gòu)存在的時(shí)間，防止花色苷分子在高溫處理和堿性條件下的快速降解。同等質(zhì)量濃度下的花色苷溶液與果膠結(jié)合后的花色苷抗氧化能力有一定程度上的減弱，但仍具備較強(qiáng)的抗氧化能力。

研究結(jié)果為黑果腺肋花楸花色苷與果膠作用機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)，對(duì)于黑果腺肋花楸相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)具有指導(dǎo)意義。