馮 芳，劉文豪，陳志剛,

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.河南向上食品有限公司，河南 鶴壁 456250）

大豆分離蛋白具有許多功能特性，因此廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[1]，例如添加至肉制品中可以改善產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)和保水性[2]。大豆7S和11S蛋白是大豆分離蛋白的主要組分，約占組分70%以上[3]，與大豆分離蛋白的功能性質(zhì)密切相關(guān)[4]。大豆7S蛋白，也被稱為β-伴大豆球蛋白[5]，約占大豆球蛋白的34%[5]，是分子質(zhì)量約為150～200 kDa的三聚體共軛型糖蛋白[1]，主要由α′（≈71 kDa）、 α（≈67 kDa）和β（≈50 kDa）亞基[6]組成。大豆11S蛋白，又稱為大豆球蛋白[5]，約占大豆種子中球蛋白的42%[7]，是分子質(zhì)量為300～380 kDa的六聚體非糖蛋白[1]，由酸性亞基（35～37 kDa）[8]和堿性亞基（20 kDa）[8]通過二硫鍵連接在一起[9]，大豆11S蛋白含硫氨基酸豐富，具有良好的凝膠保水性[5]。

凝膠性作為大豆分離蛋白的重要功能性質(zhì)之一，不僅應(yīng)用于食品工業(yè)，同時其展現(xiàn)的優(yōu)良性能也為其他領(lǐng)域的應(yīng)用提供廣闊前景[10]。大豆分離蛋白成膠方式較多，例如加熱、加酸、離子誘導(dǎo)等，均使蛋白形成凝膠[11]。蛋白凝膠性受多種因素的影響，包括內(nèi)在因素如表面疏水性、巰基等因素，這些因素影響著蛋白凝膠的形成。除此之外，外在因素如蛋白質(zhì)量濃度、加熱溫度、pH值、Na＋質(zhì)量濃度等也是影響凝膠作用的重要因素[12]。

凝膠形成的過程首先是巰基、疏水基團(tuán)等功能性基團(tuán)的逐漸暴露，緊接著暴露的基團(tuán)通過疏水、氫鍵、靜電相互作用或二硫鍵形成聚集體，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度足夠高，會進(jìn)一步形成凝膠[13]。由于蛋白質(zhì)在熱凝膠形成過程中產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化，因此官能團(tuán)的變性以及暴露程度會影響凝膠的形成[14]。

本研究通過對大豆7S和11S蛋白的表面疏水性、巰基、粒徑等理化性質(zhì)進(jìn)行測定，通過傅里葉紅外光譜法對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并研究蛋白質(zhì)量濃度、加熱溫度、pH值、Na＋質(zhì)量濃度對凝膠的影響通過蛋白凝膠的硬度、膠黏性及彈性反映凝膠特性，進(jìn)而探討大豆7S和11S蛋白的結(jié)構(gòu)與凝膠性的關(guān)系，為改善其凝膠性及擴(kuò)大應(yīng)用范圍提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂大豆粉購于秦皇島金海食品工業(yè)有限公司。

三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris） 北京索萊寶科技有限公司；亞硫酸氫鈉 成都市科龍化工試劑廠；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、甘氨酸、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán) Biosharp生物科技公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ANS-Mg、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、四甲基乙二胺 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-7C型電泳儀 北京六一生物科技公司；Lab Tech紫外-可見分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器有限 公司；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技公司；Zetasizer Nano-zeta電位儀 英國馬爾文 公司；J-26S冷凍離心機(jī) 美國貝克曼公司；IR200傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher公司；TLP質(zhì) 構(gòu)儀 美國Food Technology Corporation公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆7S及11S蛋白的制備與純化

采用Liu Chun等[15]的方法進(jìn)行大豆7S及11S蛋白組分的制備。通過G200柱分子篩純化大豆7S蛋白：取實(shí)驗(yàn)室自制大豆7S蛋白1 mL，加入50%硫酸銨沉淀后取上清液，調(diào)pH值為6.2，離心取上清液，加0.2% TCEP。用上樣緩沖液（2.6 mmol/L KH2PO4、32.5 mmol/L K2HPO4、400 mmol/L NaCl，0.1% TCEP，pH 7.5）平衡柱后，緩慢加入蛋白溶液。

通過G200柱分子篩純化大豆11S蛋白：取實(shí)驗(yàn)室自制大豆11S蛋白1 mL，加入0.2% TCEP，0.45 μm過膜后，用上樣緩沖液（2.6 mmol/L KH2PO4、32.5 mmol/L K2HPO4、400 mmol/L NaCl，pH 8.8）平衡層析柱后，緩慢加入蛋白溶液。

1.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

用不連續(xù)垂直板狀凝膠電泳，濃縮膠為4%，分離膠為15%，凝膠厚度1 mm，上樣量10 μL。分離膠時恒壓80 V，濃縮膠時恒壓120 V，考馬斯亮藍(lán)R-250染色30 min，用脫色液進(jìn)行多次脫色直至背景清晰。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

將干燥的溴化鉀與待測樣品按質(zhì)量比100∶30充分混合，瑪瑙研缽研磨至細(xì)粉末狀，置于專用壓片機(jī)中，在10 N壓力下保持60 s，壓制成均勻透明的圓形薄片，用單純溴化鉀壓片作為空白對照。掃描范圍4 000～400 cm－1， 分辨率4 cm－1，掃描次數(shù)32 次/s。由于大豆7S和11S蛋白的二級結(jié)構(gòu)信息重疊在紅外光譜的酰胺I 帶（1 600～1 700 cm－1）[16]，酰胺I帶譜峰主要?dú)w屬于C＝O鍵伸縮振動[7]，可反映蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。通過對酰胺I帶進(jìn)行基線校正，平滑處理，在二階導(dǎo)數(shù)基礎(chǔ)上采用Gauss分峰擬合的方法[17]，得到大豆7S及11S蛋白擬合圖。

1.3.4 大豆7S及11S蛋白理化性質(zhì)的測定

1.3.4.1 表面疏水性的測定

采用ANS熒光探針法[17]。將0.06 g蛋白溶于30 mL磷酸鹽緩沖溶液（2.6 mmol/L KH2PO4、32.5 mmol/L K2HPO4，pH 7.6）緩沖液中，20 ℃攪拌1 h，8 000 r/min離心30 min。分別將大豆7S及11S蛋白稀釋成一系列質(zhì)量濃度40、80、120、160、200、240、280 μg/mL，用相同的緩沖液配制8 mol/L ANS-Mg溶液。每2 mL樣品加入10 μL ANS-Mg溶液，8 000 r/min離心5 min，在390 nm激發(fā)波長，470 nm發(fā)射波長下測樣品溶液的熒光強(qiáng)度，同時測定未加ANS的相應(yīng)質(zhì)量濃度的樣品溶液的熒光強(qiáng)度做空白。以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)S0[18]。

1.3.4.2 游離巰基含量的測定

用Ellman試劑法[19-20]測定游離巰基含量。配制Tris-Gly緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、0.04 mol/L EDTA），用2 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至8.0。用相同的Tris-Gly緩沖液配制質(zhì)量濃度為 4 mg/mL的DTNB溶液即Ellman試劑。將5 mg/mL的蛋白溶液和Tris-Gly緩沖液1∶1混合稀釋，每5 mL稀釋溶液加入50 μL Ellman試劑，渦旋振蕩，每個樣品測3 個平行。以加入Ellman試劑的Tris-Gly緩沖液作為空白對照。樣品及空白25 ℃保溫1 h，3 000h g離心30 min，取上清液。用分光光度計(jì)測定其在412 nm波長處的吸光度，按 下式[20]計(jì)算游離巰基含量：

式中：A為吸光度；D為稀釋倍數(shù)；C為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.4.3 總巰基含量的測定

配制Tris-Gly緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、0.04 mol/L EDTA、8 mol/L尿素），用2 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至8.0，其他條件同1.3.4.2節(jié)。

1.3.4.4 粒徑的測定

將大豆7S及11S蛋白配制為50 μg/mL的溶液，上清液用0.45 μm水系濾膜過濾，然后用Zeta電位儀測定粒徑，參數(shù)設(shè)置如下：分散介質(zhì)為蛋白質(zhì)；分散劑為水；溫度25 ℃，平衡時間60 s，樣品池DTS0012。

1.3.5 凝膠性的測定

用質(zhì)構(gòu)儀對凝膠的硬度、膠黏性及彈性進(jìn)行測定。測定模式和選項(xiàng)為TPA，測定時參數(shù)設(shè)置如下：力量感應(yīng)元為50 N，選用凝膠專用探頭P12.7，形變量30%，速率60 mm/min，間隔時間3 s，最小起始力0.05 N。

1.3.5.1 蛋白質(zhì)量濃度對凝膠性的影響

凝膠的制備參照唐曉婷等[21]的方法，稍作修改。

將蛋白樣品配制成蛋白質(zhì)量濃度0.07～0.12 g/mL的蛋白溶液，充分溶解。用保鮮膜密封，在90 ℃的恒溫水浴鍋中加熱30 min，快速冷卻至室溫，在4 ℃冰箱內(nèi)放置24 h，制得的凝膠用于測定凝膠性。

1.3.5.2 溫度對凝膠性的影響

將蛋白樣品配制成蛋白質(zhì)量濃度0.12 g/mL的溶液，充分溶解，用保鮮膜密封，分別在70、75、80、85、90、95 ℃的恒溫水浴鍋中加熱30 min，其他條件同1.3.5.1節(jié)。

1.3.5.3 pH值對凝膠性的影響

將蛋白樣品配制成蛋白質(zhì)量濃度0.12 g/mL的溶液，充分溶解，分別調(diào)節(jié)pH值為2～10，于90 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min，其他條件同1.3.5.1節(jié)。

1.3.5.4 Na＋質(zhì)量濃度對凝膠性的影響

將蛋白樣品配制成蛋白質(zhì)量濃度0.12 g/mL的溶液，充分溶解，分別添加NaCl，制成0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012 g/mL的溶液，于90 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min，其他條件同1.3.5.1節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以f s表示，采用IBM SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用OriginPro 9.1軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆7S及11S蛋白的SDS-PAGE結(jié)果分析

圖 1 大豆7S和11S蛋白SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE patterns of soybean 7S and 11S proteins

由圖1可以看出，泳道2顯示實(shí)驗(yàn)室自提大豆11S蛋白被大豆7S蛋白輕微污染，而實(shí)驗(yàn)室自提大豆7S蛋白主要被大豆11S蛋白的酸性亞基和堿性亞基污染。這主要是因?yàn)樘崛〈蠖?S蛋白的pH值為4.8，在此pH值條件下，溶液中所有的蛋白均被提取出來，因此溶液中殘留的大豆11S蛋白亞基及其他蛋白會污染大豆7S蛋白，使大豆7S蛋白純度降低。因此實(shí)驗(yàn)室自提條件下，大豆11S蛋白純度高于大豆7S蛋白。

2.2 大豆7S和11S蛋白純化

圖 2 分子篩G200純化大豆7S（A）及11S（B）蛋白圖譜Fig. 2 Sephadex G-200 molecular-sieve chromatograms of soybean 7S (A) and 11S (B) proteins

圖 3 純化后大豆7S及11S蛋白SDS-PAGE圖譜Fig. 3 SDS-PAGE patterns of purified soybean 7S and 11S proteins

大豆7S蛋白純化（圖2A），對P1～P7處的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析后，P4處的蛋白純度較高，即圖3泳道2，純化后的大豆7S蛋白純度在95%以上。大豆11S蛋白純化（圖2B），對P1～P7處的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析后，P5處的蛋白純度較高，即圖3泳道3，純化后的大豆11S蛋白純度在95%以上。

2.3 蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)

如圖4所示，酰胺I帶中各子峰與二級結(jié)構(gòu)的對應(yīng)關(guān)系：1 612 cm－1附近的吸收峰為蛋白質(zhì)和多肽的側(cè)鏈吸收；1 618～1 640 cm－1為β-折疊結(jié)構(gòu)；1 640～1 649 cm－1為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)；1 650～1 660 cm－1為α-螺旋結(jié)構(gòu)；1 660～1 700 cm－1為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[7]。通過對各子峰積分面積的計(jì)算，得出大豆7S及11S蛋白的二級結(jié)構(gòu)信息， 見表1。大豆7S及11S蛋白的二級結(jié)構(gòu)中β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量較高；α-螺旋和無規(guī)卷曲相對含量較少。大豆7S蛋白的β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲的相對含量略高于大豆11S蛋白，而大豆11S蛋白α-螺旋及β-折疊含量略高于大豆7S蛋白。

圖 4 大豆7S和11S蛋白紅外光譜圖Fig. 4 FT-IR spectra of soybean 7S and 11S proteins

表 1 大豆7S及11S蛋白紅外光譜酰胺I帶擬合結(jié)果Table 1 Secondary structure contents of 7S and 11S proteins based on second-derivative FT-IR spectra in the amide I region

2.4 蛋白理化性質(zhì)

表 2 大豆7S和11S蛋白理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of soybean 7S and 11S proteins

游離巰基與總巰基的比值反映了蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的解折疊程度，游離巰基與總巰基的比值越大，蛋白的解折疊程度越高，分子結(jié)構(gòu)越趨于暴露式，疏水性殘基的增強(qiáng)使得表面疏水性增強(qiáng)[22]。研究表明，蛋白質(zhì)的表面疏水性顯著影響蛋白質(zhì)的凝膠性等功能特性[23]。由表2可知，大豆7S蛋白的游離巰基/總巰基的比值為93.82%，高于大豆11S蛋白的82.85%，這說明大豆7S蛋白的解折疊程度高于大豆11S蛋白，蛋白質(zhì)的表面疏水性主要取決于暴露在蛋白質(zhì)分子表面的疏水性殘基[24]，疏水基團(tuán)暴露程度大，使得大豆7S蛋白表面疏水性（136.79）也大于大豆11S蛋白（83.08），符合解折疊程度大，表面疏水性增大的規(guī)律。

由表2可以看出，大豆11S蛋白粒徑分布主要在100 nm以上，大豆7S蛋白粒徑分布主要在10～100 nm，這是由于大豆11S蛋白在中性條件下的溶解性小于在堿性條件下的溶解性，溶于水后的大豆11S蛋白形成了聚集體。蛋白質(zhì)的粒徑分布越大，說明聚集體形成的越多，這會減少蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)的暴露，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性降低[25]，與表2結(jié)果一致。蛋白的表面疏水性也與二級結(jié)構(gòu)相關(guān)，表面疏水性隨著α-螺旋、β-折疊的增大而減小，隨著β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的增大而增大。大豆7S蛋白的α-螺旋、β-折疊含相對量均低于大豆11S蛋白，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量均高于大豆11S蛋白（表1），因此大豆7S蛋白的表面疏水性高于大豆11S蛋白（表2）。

2.5 凝膠性結(jié)果

圖 5 蛋白質(zhì)量濃度（A）、溫度（B）、pH值（C）和Na＋ 質(zhì)量濃度（D）對大豆7S及11S蛋白凝膠的影響Fig. 5 Effects of protein concentration (A), temperature (B), pH (C) and Na+ concentration (D) on appearance of soybean 7S and 11S protein gels

圖 6 蛋白質(zhì)量濃度（A）、溫度（B）、pH值（C）及 Na＋ 質(zhì)量濃度（D）對大豆7S蛋白凝膠的影響Fig. 6 Effects of protein concentration (A), temperatures (B), pH (C) and Na+ concentration of (D) on gel texture properties of soybean 7S protein

圖 7 蛋白質(zhì)量濃度（A）、溫度（B）、pH值（C）及 Na＋ 質(zhì)量濃度（D）對大豆11S蛋白凝膠的影響Fig. 7 Effects of protein concentration (A), temperature (B), pH (C) and Na+ concentrations (D) on gel texture properties of soybean 11S protein

蛋白濃度是凝膠形成的決定性因素之一[26]。濃度過低時，蛋白質(zhì)-溶劑的相互作用起主導(dǎo)作用，隨著蛋白濃度的增加，蛋白質(zhì)間相互作用加強(qiáng)，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較密實(shí)[10]。如圖5～7所示，在蛋白質(zhì)量濃度為0.07～0.09 g/mL時，大豆7S及11S蛋白形成的凝膠仍具有流動性。從圖6A、7A可以看出，在蛋白質(zhì)量濃度為0.1～0.12 g/mL時，凝膠硬度及膠黏性均隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，而蛋白質(zhì)量濃度對大豆7S蛋白的彈性影響較?。◤椥宰兓秶?.13～3.39 mm），對大豆11S蛋白彈性影響較大（彈性變化范圍在0.88～3.31 mm）。

加熱處理是使蛋白質(zhì)凝膠化的常見方法[13]，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)分子受熱變性，環(huán)狀結(jié)構(gòu)展開成伸展的鏈狀，原本埋在卷曲結(jié)構(gòu)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露 出來[27]，有利于分子間通過疏水性相互作用形成交聯(lián)。當(dāng)溫度為70、75 ℃時，大豆7S及11S蛋白無法形成凝膠（圖5B）。溫度低于80 ℃時，蛋白質(zhì)游離巰基含量較少，且蛋白質(zhì)分子間的相互接觸少，因此容易導(dǎo)致聚集體的形成，而不利于凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成[28]。圖6B顯示，當(dāng)溫度高于90 ℃，大豆7S蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重，因此凝膠的硬度及膠黏性呈下降趨勢。圖7B顯示，隨著溫度升高至95 ℃，凝膠硬度及膠黏性持續(xù)增加。由圖6B、7B可知，大豆11S蛋白形成凝膠比大豆7S蛋白形成凝膠需要更高溫度，且硬度、膠黏性大豆11S蛋白也更高，主要是因?yàn)榇蠖?1S蛋白凝膠中形成的二硫鍵數(shù)量比大豆7S蛋白形成的多[4]。

pH值的改變會影響蛋白質(zhì)分子的離子化作用和凈電荷值，從而改變蛋白質(zhì)分子間的相互作用以及蛋白質(zhì)分子與溶劑分子結(jié)合的能力，因此會影響凝膠形成和維持的作用力[29]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大豆7S蛋白在pH 2和pH 10時不能形成凝膠，整體呈流體；pH 4和pH 5時由于靠近大豆7S蛋白的等電點(diǎn)（pI 4.8），蛋白質(zhì)絮凝聚集不能形成凝膠（圖5C1）。圖6C顯示，大豆7S蛋白凝膠硬度在pH 6時最大，彈性在pH 7時最大。大豆11S蛋白在pH 2和pH 3時不能形成凝膠，可能是由于強(qiáng)酸條件下，球蛋白的空間結(jié)構(gòu)在很大程度上展開，分子間的二硫鍵斷裂[30]； pH 4、pH 5和pH 6時由于靠近大豆11S蛋白的等電點(diǎn)（pI 6.4），蛋白質(zhì)聚集不能形成凝膠，尤其是pH 6時，蛋白質(zhì)聚集的同時有大量的水析出（圖5C2）。由圖7C可看出，堿性條件更適合大豆11S蛋白凝膠的形成。當(dāng)pH值在等電點(diǎn)附近時，蛋白質(zhì)分子的電荷降低，分子間相互排斥作用下降，蛋白質(zhì)隨機(jī)聚合形成“粗凝膠”，這種凝膠彈性差，表面粗糙，有水析出；當(dāng)pH值逐漸遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時，分子間相互排斥作用增強(qiáng)，聚合變得緩慢從而形成規(guī)則有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)，凝膠變得透明彈性增加[31]。

中性鹽對蛋白質(zhì)溶液可產(chǎn)生2 種影響：一是鹽離子與蛋白質(zhì)分子中的極性和離子基團(tuán)作用，降低蛋白質(zhì)分子的活度系數(shù)，使其溶解度增加；二是鹽離子也與偶極分子水作用，使水的活度系數(shù)降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水合程度降低，使蛋白質(zhì)溶解度減少，蛋白質(zhì)沉淀[32]。從圖6D、7D可看出，隨著Na＋質(zhì)量濃度的增加，凝膠硬度和膠黏性呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢，因?yàn)榈唾|(zhì)量濃度時，Na＋屏蔽了蛋白質(zhì)表面的電荷，從而減少了蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力[33]，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的溶解度，同時加熱更有利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開和基團(tuán)的暴露，隨著Na＋質(zhì)量濃度的加入，蛋白的變性溫度變高，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開和基團(tuán)的暴露較少，同時蛋白質(zhì)的重新折疊作用，不利于凝膠的形成[31]，從實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象也可看出，隨著Na＋質(zhì)量濃度增加，蛋白質(zhì)逐漸析出，凝膠的外觀形態(tài)由透明細(xì)膩?zhàn)兊冒l(fā)白粗糙（圖5D）。

因此，形成凝膠的最優(yōu)條件，要同時考量凝膠的硬度，膠黏性以及彈性。大豆7S蛋白形成凝膠最優(yōu)條件為蛋白質(zhì)量濃度0.12 g/mL、溫度90 ℃、pH 6～8、Na＋質(zhì)量濃度0.002 g/mL。大豆11S蛋白形成凝膠最優(yōu)條件為蛋白質(zhì)量濃度0.12 g/mL、溫度95 ℃、pH 8～9、Na＋質(zhì)量濃度0.002 g/mL。

3 結(jié) 論

本研究表明凝膠性受多種因素共同影響，主要分為內(nèi)在因素以及外在因素。凝膠形成首先是通過蛋白質(zhì)的變性，即蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變以及功能性基團(tuán)（巰基、疏水基團(tuán)等）的暴露[13]，這將有利于蛋白質(zhì)接下來通過二硫鍵、氫鍵等相互作用，從而進(jìn)一步形成凝膠。巰基、粒徑和表面疏水性這些理化指標(biāo)可以反映出蛋白質(zhì)分子暴露的程度，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室自提大豆7S及11S蛋白，在水溶液中大豆7S蛋白暴露程度更大，表面疏水性也更大，這更有利于蛋白間的相互作用。但是，外界條件的改變會影響蛋白的內(nèi)在因素，因此外在因素對凝膠形成也起到重要作用。

當(dāng)?shù)鞍诐舛容^低時，蛋白間的相互作用較弱，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)薄弱不利于凝膠的形成。溫度在熱凝膠起始的變性階段起到了重要作用，蛋白質(zhì)分子受熱變性，環(huán)狀結(jié)構(gòu)變成鏈狀結(jié)構(gòu)，疏水基團(tuán)暴露更有利于分子間交聯(lián)，但是當(dāng)溫度高于90 ℃時，大豆7S蛋白的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到了破壞，凝膠質(zhì)構(gòu)性下降，由于大豆11S蛋白凝膠中二硫鍵更多，因此溫度的升高更有利于大豆11S蛋白凝膠的形成。pH值影響蛋白質(zhì)分子的吸引力和排斥力，因此在等電點(diǎn)附近，大豆7S和11S蛋白聚集沉淀，而遠(yuǎn)離等電點(diǎn)凝膠變得透明且富有彈性。Na＋質(zhì)量濃度在0.002 g/mL時，大豆7S和11S蛋白均能形成較好的凝膠，而隨著Na＋質(zhì)量濃度的增大，凝膠質(zhì)構(gòu)特性逐漸降低。

凝膠的形成是內(nèi)外因素共同作用的結(jié)果，分析凝膠形成的條件應(yīng)該從多因素相互影響相互制約的角度分析。本研究表明，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)決定了蛋白的表面疏水性，而表面疏水性影響了凝膠的形成，同時凝膠形成的各外在因素又影響著蛋白的表面疏水性。同時，本研究對于蛋白的其他功能性質(zhì)研究提供了新策略，具有一定參考價值。