譚文倩 李銳 于鑫 蔣露芳 王娜 王和興 姜慶五

（復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室-公共衛(wèi)生安全教育部重點實驗室 上海 200032）

黃連素提取自我國傳統(tǒng)的中藥材，近年來其降血脂效用得到研究者們的廣泛關(guān)注。大量研究已經(jīng)確認0.6～2.7 g/天的黃連素可以有效降低患者血中總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）和低密度脂蛋白膽固醇含量并提升高密度脂蛋白膽固醇含量［1-4］，其廣泛應(yīng)用于2型糖尿病、高脂血癥及心血管疾病的治療中［5-7］。最近，低劑量黃連素（0.5 g/天）也被提議用作功能食品調(diào)節(jié)血脂，并日常應(yīng)用于高脂血癥等疾病的預(yù)防控制中［8-9］。盡管在高脂血癥患者中能觀察到降血脂效果，但其對一般狀態(tài)下機體血脂的影響還需進一步研究。

許多研究探索了黃連素調(diào)節(jié)血脂的機制［10］，但口服黃連素的腸道吸收率低于1%［11］，其調(diào)節(jié)血脂的機制很可能經(jīng)由機體的腸道菌群并通過其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）和膽汁酸（bile acid，BA）影響血脂［12-14］。SCFA在盲腸和結(jié)腸中由腸道菌群發(fā)酵難消化碳水化合物產(chǎn)生，其可通過腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、游離脂肪酸受體2和3（Ffar2、Ffar3）在不同的組織中影響脂質(zhì)代謝［15］。而腸道菌群可以調(diào)節(jié)BA的組成，并可由此介導(dǎo)細胞核激素受體——法尼醇受體X（FXR）和跨膜G蛋白偶聯(lián)受體5（TGR5）以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝與能量消耗［14，16］。目前，已有部分高劑量黃連素研究證據(jù)支持這一作用機制［13，16-17］，但尚不明確低劑量黃連素能否由此對血脂進行調(diào)節(jié)。

為進一步揭示黃連素對血脂的影響及其作用機制，本實驗擬研究低劑量黃連素對正常小鼠血脂、腸道SCFA及BA的影響，為該藥降血脂作用的機制研究及其合理應(yīng)用提供科學(xué)證據(jù)。

材料和方法

材料與試劑40只清潔級3周齡C57BL/6小鼠，雌雄各半，購自復(fù)旦大學(xué)實驗動物科學(xué)部。黃連素（Berberine，BBR）（生產(chǎn)批號：K041G005）購于上海安譜實驗科技公司。膽酸（cholic acid，CA）、去氧膽酸（deoxycholic acid，DCA）、鵝去氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）、石膽酸（lithocholic acid，LCA）、熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）、豬去氧膽酸（hyodeoxycholic acid，HDCA）、?；悄懰幔╰aurocholic acid，TCA）、?；蛆Z膽酸鹽（taurochenodeoxycholate，TCDC）、甘氨脫氧膽酸鹽（glycochenodeoxycholate，GCDC）、甘氨膽酸（glycocholic acid，GCA）及同位素標記的膽汁酸均購自美國Sigma-Aldrich公司。乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PPA）、丁酸（n-butyric acid，NBA）、異丁酸（isobutyric acid，IBA）、戊酸（n-valeric acid，NVA）、異戊酸（isovaleric acid，IVA）及2-乙基丁酸（2-ethylbutyric acid，EBA）購于德國Dr.Ehrenstorfer公司。血總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）、三酰甘油（TG）、載脂蛋白A1（apolipoprotein A1，Apo A1）和脂蛋白（a）［lipoprotein（a），Lp（a）］測定試劑盒購于上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)公司。其余為國產(chǎn)分析純試劑。

動物分組與處理本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)動物倫理委員會批準。經(jīng)過1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，使用簡單隨機法將40只C57BL/6小鼠隨機分為對照組和BBR低、中、高劑量組（10、20、40 mg·kg-1·d-1），每組雌雄各半。依照小鼠150 mL·kg-1·d-1［18］的飲水量分別以66.7、133.4和266.8 mg/L的濃度被添加入飲水中。暴露劑量參考黃連素作為功能食品的推薦劑量［8-9］。所有分組均給予正常飲食并自由飲水?dāng)z食。4周后測量小鼠體脂率及瘦體重率；禁食不禁水12 h后，眼球取血，頸椎脫臼處死，解剖并收集小鼠結(jié)腸內(nèi)容物，-80 ℃保存。

身體脂率、瘦體重率及血脂的測定小鼠的身體脂肪、水份、瘦體重、體脂率及瘦體重率經(jīng)Meso-QMR核磁共振分析儀（蘇州鈕邁分析儀器股份有限公司）測定。血脂指標的檢測包括血總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、三酰甘油、載脂蛋白A1和脂蛋白（a），均使用BECKMAN COULTER AU680全自動生化分析儀（美國Beckman公司）測定。

短鏈脂肪酸的檢測短鏈脂肪酸的檢測包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸，依照本實驗室先前建立的檢測方法進行［19］。將50 mg的結(jié)腸內(nèi)容物與1 mL 0.5 mol/L草酸溶液混合，加入2-乙基丁酸作為內(nèi)標，充分反應(yīng)5 min。以6 000×g的速度離心10 min后，將上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾。取1 μL濾液用氣相色譜儀聯(lián)合火焰離子化檢測器（GC-FID）進行短鏈脂肪酸定量分析。

色譜條件 色譜柱：DB-FFAP彈性石英毛細管柱（30 m×0.53 mm×1.0 μm）；色譜柱升溫程序：初始溫度50 ℃保持1 min，以20 ℃/min的速度升至180 ℃保持1 min，再以20 ℃/min的速度升至200 ℃保持2 min。進樣口溫度200 ℃～240 ℃；分流比30∶1；載氣為氮氣，流速6.44 mL/min；尾吹氣為氮氣，流速30 mL/min；氫氣流速40 mL/min；空氣流速400 mL/min。

膽汁酸的檢測膽汁酸的檢測包括膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸、石膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸、?；悄懰?、?；蛆Z膽酸鹽、甘氨脫氧膽酸鹽和甘氨膽酸，使用液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)［19］。取50.0 mg結(jié)腸內(nèi)容物并加入同位素標記物L(fēng)CA-d4和CA-d5作為內(nèi)標物，將其與1 mL 0.2 mol/L NaOH充分混合20 min后，以6 000×g的速度離心10 min，重復(fù)3次。將提取的上清液加至甲醇水溶液（1∶1）活化后的HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL）中，以2 mL 20%甲醇水溶液洗滌柱，并使用3 mL含1%甲酸的乙腈甲醇溶液（9∶1）洗脫膽汁酸。弱氮氣流氣化揮干洗脫液后，將膽汁酸以0.5 mL 50%甲醇水溶液重新溶解，用0.22 μm微孔濾膜過濾。吸取10 μL濾液用超高效液相色譜串聯(lián)高分辨率四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Tof-MS）進行定量分析。

色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3超高效液相色譜柱（100 mm×3.0 mm×1.8 μm）；柱溫50 ℃；流速0.55 mL/min；流動相為甲醇和含有0.1%甲酸的水溶液。線性洗脫程序：0～3 min，甲醇從5%增至35%；3～6 min，甲醇增至65%；6～8 min，甲醇增至80%；8～9 min，甲醇增至90%；9～10 min，甲醇增至95%；10～10.5 min，甲醇增至98%；10.5～11 min，甲醇降至5%并保持至12 min。

質(zhì)譜條件 脫溶劑氣為氮氣；碰撞氣為氬氣；脫溶劑氣流速800 L/h，錐孔氣流速30 L/h；毛細管電壓2.8 kV；錐孔電壓30 V；脫溶劑氣溫度400 ℃；源溫度110 ℃。

數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 25.0軟件和Graphpad prism 8.0進行數(shù)據(jù)分析與呈現(xiàn)。正態(tài)性檢驗使用Shapiro-Wilk檢驗，方差同質(zhì)性檢驗使用Levene檢驗，對不符合正態(tài)分布和方差同質(zhì)性的數(shù)據(jù)進行對數(shù)變換后再比較。符合正態(tài)分布和/或方差同質(zhì)性的數(shù)據(jù)使用雙因素方差分析或單因素方差分析，事后比較使用Dunnett'st-test。不符合正態(tài)分布的資料使用Kruskal-Wallis H檢驗。劑量反應(yīng)關(guān)系使用Spearman秩和分析方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

低劑量黃連素對小鼠體重、體脂率及瘦體重率的影響4周內(nèi)雌雄小鼠體重的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，體重增加在正常范圍內(nèi)（圖1）。雌雄小鼠第4周末體脂率及瘦體重率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。

低劑量黃連素對小鼠腸道短鏈脂肪酸的影響各組小鼠腸道短鏈脂肪酸含量如圖3所示。雄性20 mg/kg組小鼠腸道中異丁酸和異戊酸含量明顯高于對照組（異丁酸：P=0.008；異戊酸：P=0.027），各組乙酸、丙酸、丁酸、戊酸及總短鏈脂肪酸含量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。雌性小鼠各組間短鏈脂肪酸含量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

低劑量黃連素對小鼠腸道膽汁酸的影響各組小鼠腸道膽汁酸含量如圖4所示。雌性小鼠10 mg/kg組腸道膽酸、石膽酸以及熊去氧膽酸與豬去氧膽酸含量之和明顯高于對照組（膽酸：P=0.03；石膽酸：P=0.023；熊去氧膽酸和豬去氧膽酸：P=0.02），且20 mg/kg組膽酸含量亦高于對照組。其余各類膽汁酸含量與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

而雄性小鼠中，膽酸、鵝去氧膽酸、牛磺膽酸和去氧膽酸隨劑量升高而升高（膽酸：P=0.005；鵝去氧膽酸：P=0.004；?；悄懰幔篜=0.004；去氧膽酸：P=0.008），其余各膽汁酸含量與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

低劑量黃連素對小鼠血脂的影響由圖5可見，喂養(yǎng)4周后，雄性實驗組小鼠的血清三酰甘油隨著黃連素劑量升高呈現(xiàn)下降趨勢（10 mg/kg組：P=0.009；20 mg/kg組：P=0.001；40 mg/kg組：P＜0.001）。而血總膽固醇，高密度脂蛋白，低密度脂蛋白，載脂蛋白A1和脂蛋白（a）含量與對照組相比的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各組雌性小鼠的血脂指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

本研究選取正常飲食的C57BL/6小鼠作為研究對象，并選用了黃連素作為功能食品的推薦劑量作為暴露劑量［8-9］，探索了低劑量黃連素對普通狀態(tài)機體的血脂調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示低劑量黃連素增加了正常飲食小鼠腸道短鏈脂肪酸及膽汁酸的含量，并能降低其血清三酰甘油水平，但其效應(yīng)有明顯的性別差異。這與Jia［20］及Hu［21］等研究中使用雄性高脂飲食動物模型進行黃連素干預(yù)的結(jié)果一致，補充了低劑量黃連素對普通狀態(tài)機體血脂調(diào)節(jié)的數(shù)據(jù)資料。但既往研究較少使用雌性動物，黃連素對雌性的血脂調(diào)節(jié)作用還需更廣泛的動物及臨床試驗進行驗證。短鏈脂肪酸是腸道菌群在腸道中發(fā)酵難消化碳水化合物產(chǎn)生的小分子化合物，能被快速吸收進入血液，在許多組織中加快脂肪酸的氧化，還能減少脂肪在白色脂肪組織中儲存［25］，是機體能量吸收與物質(zhì)代謝的關(guān)鍵物質(zhì)［12，15］。本研究首次發(fā)現(xiàn)低劑量黃連素的使用增加了小鼠異丁酸和異戊酸的含量。異丁酸和異戊酸可以減少激素敏感性脂肪酶（HSL）的磷酸化作用［22］，并由此抑制異丙腎上腺素刺激導(dǎo)致的脂肪生成［23］。異丁酸和異戊酸還能抑制胰島素介導(dǎo)的脂肪生成，對機體脂質(zhì)代謝平衡有重要影響［22］，這與研究結(jié)果中短鏈脂肪酸含量變化與血脂指標變化相符。在倉鼠中的實驗研究發(fā)現(xiàn)，相對高劑量（100 mg·kg-1·d-1）黃連素導(dǎo)致丁酸產(chǎn)生細菌的富集并增加丁酸的產(chǎn)生，降低血脂水平［13］。這些研究結(jié)果提示黃連素導(dǎo)致的菌群結(jié)構(gòu)改變可能是短鏈脂肪酸含量及血脂水平變化的重要原因［17］。本研究結(jié)果僅觀察到異丁酸和異戊酸含量的變化，還需要深入研究低劑量黃連素對腸道菌群結(jié)構(gòu)特別是異丁酸、異戊酸產(chǎn)生菌的影響，并進一步探討異丁酸和異戊酸對血脂作用的影響與機制。

膽汁酸不但能促進脂質(zhì)的消化吸收，還是重要的信號分子，在脂質(zhì)代謝與膽固醇平衡的調(diào)節(jié)中扮演了重要角色［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，3種初級膽汁酸（膽酸、鵝脫氧膽酸和牛磺膽酸）含量在雄性小鼠中隨黃連素劑量升高而升高，這一結(jié)果與Guo等［24］和Sun等［16］的研究一致，而且在雄性小鼠中發(fā)現(xiàn)黃連素導(dǎo)致1種次級膽汁酸（去氧膽酸）含量升高。有研究報道膽酸、鵝脫氧膽酸、?；悄懰峒叭パ跄懰峋芗せ罘岽际荏wX（FXR）［14］，增加肝臟脂肪酸氧化，由此降低三酰甘油水平［25］，激活FXR，提高極低密度脂蛋白受體的表達并加快血三酰甘油的清除［25］。這與本研究中雄性小鼠實驗組三酰甘油水平降低的結(jié)果相符，黃連素可能通過增加初級膽汁酸及部分次級膽汁酸含量而發(fā)揮降血脂作用。盡管在雌性小鼠中，黃連素也導(dǎo)致膽酸和熊去氧膽酸或豬去氧膽酸含量增加，但熊去氧膽酸則會抑制FXR的活化［26］，對三酰甘油的清除造成影響，這可能部分解釋了為何在雌性小鼠中未觀察到血脂降低的現(xiàn)象。

本研究僅在雄性小鼠中觀察到血清三酰甘油水平下降及異丁酸、異戊酸含量升高，且雌雄性小鼠膽汁酸的差異種類各有不同，這可能與腸道菌群有關(guān)。雌雄小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異［27］，而腸道菌群結(jié)構(gòu)不僅會影響機體短鏈脂肪酸、膽汁酸和脂質(zhì)代謝［14-15，28］，還與藥物的代謝及療效息息相關(guān)［29］。腸道菌群可產(chǎn)生水解酶、氧化還原酶等多種酶類，進行水解、還原、甲基化等一系列生化反應(yīng)，從而影響藥物的活性及生物利用度［29］。不同的腸道細菌對黃連素的生物轉(zhuǎn)化存在差異［30］，而且腸道菌群還在黃連素代謝物的腸肝循環(huán)中起重要作用［31］。這可能是雌雄小鼠對黃連素藥效的敏感性存在差異的重要原因。

上述結(jié)果提示，黃連素的降血脂效應(yīng)與短鏈脂肪酸和膽汁酸存在關(guān)聯(lián)。但短鏈脂肪酸和膽汁酸含量受多種因素影響，在體內(nèi)不斷變化［32-33］，本研究基于實驗終點進行單次取樣測量，不能靈敏地反映其代謝變化情況，對探討腸道代謝物與血脂之間的關(guān)系有一定局限性。尚需利用體外實驗或體內(nèi)熒光標記等方式進一步對腸道代謝物進行動態(tài)研究。此外，本研究僅使用低劑量黃連素開展動物試驗研究，小鼠和人體的生理狀態(tài)存在一定差異，后續(xù)還需更廣泛的人群試驗評估低劑量黃連素對普通人群血脂及健康的影響。

綜上所述，使用低劑量黃連素可以降低正常飲食小鼠血清三酰甘油水平、調(diào)節(jié)血脂，其作用可能通過影響短鏈脂肪酸及膽汁酸含量實現(xiàn)，但其降血脂效應(yīng)存在明顯性別差異，需進一步研究低劑量黃連素對腸道菌群的影響及其對血脂影響的性別差異原因。以上結(jié)果為黃連素的合理應(yīng)用和降血脂作用的機制研究提供了證據(jù)，補充了低劑量黃連素對普通狀態(tài)機體血脂調(diào)節(jié)的數(shù)據(jù)資料，可為進一步評估低劑量黃連素作為功能食品在高脂血癥等疾病的預(yù)防和治療中的應(yīng)用前景提供科學(xué)依據(jù)。