戴建華，張彤宇,2，孫 遜，劉 博，王永娟

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；3.阜寧縣農(nóng)業(yè)林業(yè)局，阜寧 224400；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130000）

呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）最早由Kaschula等[1]在南非報道，多侵害40日齡以內(nèi)的番鴨，最常見于10～25日齡的雛番鴨，有時也感染鵝。發(fā)病鴨精神沉郁，食欲減少或廢絕，腳軟不愿走動，擁擠成堆，腹瀉；肝脾出現(xiàn)灰白色壞死，部分鴨趾關(guān)節(jié)或跗關(guān)節(jié)腫脹[2]，在感染宿主多個組織器官的同時，可以誘導(dǎo)肝臟、脾臟、胸腺、腔上囊細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，以脾臟的單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞發(fā)生的凋亡最為突出[3]。免疫力低下的發(fā)病鴨群常發(fā)生繼發(fā)性感染而使得病理變化更加復(fù)雜，甚至出現(xiàn)大批病雛鴨突然死亡的情況，給番鴨養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。根據(jù)核酸電泳遷移率不同，可將MDRV的dsRNA分為10個節(jié)段：3個大基因節(jié)段（L1、L2、L3），3個中基因節(jié)段（M1、M2、M3）和4個小基因節(jié)段（S1、S2、S3、S4）[5]。σC蛋白是由S1基因表達(dá)的一種寡聚蛋白，序列相對保守，單體分子量34.9 KDa，形成同源三聚體后分子量為107 KDa，分布在外衣殼上[6]。作為外殼蛋白中最小的一個，σC蛋白可以和細(xì)胞受體特異性結(jié)合，識別宿主細(xì)胞啟動病毒感染，亦可以誘導(dǎo)細(xì)胞融合，使受感染細(xì)胞形成合胞體，產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）[7-8]。本研究擬利用RTPCR技術(shù)擴(kuò)增σC基因，構(gòu)建原核表達(dá)重組載體，獲得重組蛋白，并通過Western blot鑒定其反應(yīng)原性，為進(jìn)一步開展呼腸孤病毒的生物學(xué)特性、免疫學(xué)功能和血清學(xué)檢測的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株和載體番鴨呼腸孤病毒（MDRV-89026株）和陽性血清由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、pET24a原核表達(dá)載體、BL21(DE3)由本實驗室保存。

1.2 主要試劑DNA Marker、限制性內(nèi)切酶、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、小量提取質(zhì)粒試劑盒購自Fermentas公司；In-Fusion HD Cloning Plus購自Takara公司；HRP-標(biāo)記羊抗鼠IgG、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購自KPL公司；病毒基因組提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純級別。

1.3 引物設(shè)計與合成根據(jù)MDRV-89026株σC基因序列（GenBank登錄號：AJ310525.1），結(jié)合Infusion用戶操作手冊，利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計引物。上游引物：5"-TGGTGGTGGTGGTGCTCG AGAATGGTCGCAATGGAGAAG-3"；下游引物：5"-AGAAGGAGATATACATATGATGTACAGTGTT CCATCCTGCTC-3"。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.4 σC基因的PCR擴(kuò)增按照Viral RNA Kit說明書提取病毒基因組RNA，無核酸酶超純水溶解后分光光度計測定濃度與純度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后置于-80℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系50 μL：Pfu DNA Polymerase 1 μL，10×Buffer 5 μL，dNTP （2 mmol/L）5 μL，上、下游引物各2 μL， cDNA2 μL、ddH2O 33μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，49℃退火30 s，72℃延伸 1.5 min，30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送測序。

1.5 PET24a-C重組質(zhì)粒構(gòu)建參照In-fusion用戶操作手冊，將原核表達(dá)載體pET24a酶切后純化回收，與純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行同源重組，構(gòu)建pET24a-C重組表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，隨機(jī)選取單菌落進(jìn)行單酶切鑒定，挑選陽性克隆送測序公司測序。

1.6 σC重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)選取陽性菌，置于37℃條件下培養(yǎng)至OD600值為0.4～0.6時，加入終濃度為 1 mmol/L的IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h。收集菌體，用1×PBS緩沖液懸浮，超聲破碎后離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定目的蛋白表達(dá)情況。設(shè)置pET24a空載體作為對照。

1.7 σC重組蛋白的Western blot鑒定采用濕轉(zhuǎn)印法將經(jīng)SDS-PAGE分離后的重組蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維（NC）膜上，以5%BSA為封閉液、MDRV陽性血清為一抗、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行Western blot鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 σC基因的PCR擴(kuò)增采用Infusion克隆法，在無需對PCR片段進(jìn)行特殊處理的情況下，擴(kuò)增獲得MDRV σC基因。電泳可見一條約940 bp的條帶，與預(yù)期大小相符（圖1），并且測序結(jié)果與目的序列一致，同源性為100%。

圖1 σC 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of σC gene

2.2 PET24a-C重組質(zhì)粒的構(gòu)建將Infusion克隆法獲得的PCR產(chǎn)物克隆到pET24a載體，轉(zhuǎn)化后隨機(jī)挑選單菌落提取質(zhì)粒，用XhoⅠ單酶切后出現(xiàn)5 200 bp和750 bp的2條片段與預(yù)期大小相符（圖2），且測序結(jié)果與目的序列一致。將正確的質(zhì)粒命名為pET24a-C。

圖2 pET24a-C 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Restriction endonucleases digestion of recombinant plasmids pET24a-C

2.3 σC重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)選取鑒定正確的陽性菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)超聲裂解后進(jìn)行SDSPAGE分析，在30 kDa處出現(xiàn)了預(yù)期大小的條帶，并以包涵體形式大量存在于沉淀中（圖3）。表明構(gòu)建的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET24a-C能在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達(dá)σC重組蛋白。

2.4 σC重組蛋白的Western blot鑒定利用MDRV陽性血清檢測表達(dá)的σC重組蛋白，Western blot檢測結(jié)果顯示，30 kDa處有明顯的印跡，空載體對照組則無印跡（圖4），表明該重組蛋白具備良好的反應(yīng)原性。這一結(jié)果將有助于后續(xù)圍繞該蛋白開展功能鑒定、診斷用抗原制備或新型疫苗研制的研究。

圖3 σC 重組蛋白的SDS-PAGE 鑒定Fig.3 SDS-PAGE Identification of σC recombinant proteins

圖4 σC 重組蛋白的Western blot 鑒定Fig.4 Western-blot Identification of σC recombinant proteins