周 艷，薛金鑫，葉 敏，張 輝，包紅朵，王 冉

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所 江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，南京210014；2.南京大學(xué)金陵學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，南京210014）

在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，多年來(lái)抗生素的濫用不僅導(dǎo)致環(huán)境與動(dòng)物機(jī)體中抗生素的大量殘留，而且多重耐藥菌和超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)也給人類健康和畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了危害[1-5]。針對(duì)耐藥性致病菌，尤其是革蘭氏陰性菌，目前尚缺乏新型抗菌藥物，而裂解性噬菌體（Bacteriophage，phage）作為一類可侵染并裂解耐藥菌的細(xì)菌病毒，已成為各國(guó)研發(fā)新型抗菌制劑的熱點(diǎn)之一。因此，噬菌體療法（Phage Therapy）有望成為改善和解決耐藥性致病菌感染的有效策略[6-9]。

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）是一類致人和幼畜胃腸道感染以及腹瀉的病原性致病菌；腸出血性大腸桿菌（EnterohemorrhagicE. coli，EHEC）O157∶H7是世界公認(rèn)的食源性病原菌和人獸共患病病原[10-14]。針對(duì)這兩種致病菌，相繼有研究表明從環(huán)境中分離到了裂解性ETEC噬菌體和EHEC O157∶H7噬菌體，并且目前已有商品化的EHEC O157∶H7裂解性噬菌體產(chǎn)品[12]。然而，自然界分離的噬菌體對(duì)宿主菌具有高度專一性[15]，噬菌體宿主譜較窄，然而在畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中，動(dòng)物疾病往往由多種致病菌導(dǎo)致，病原菌較為復(fù)雜，宿主單一的噬菌體很難對(duì)疾病進(jìn)行有效控制[16-18]，作為抗菌制劑在應(yīng)用時(shí)會(huì)受到制約。如何在已有噬菌體的基礎(chǔ)上，簡(jiǎn)便快速地拓寬噬菌體宿主譜，目前相關(guān)的研究報(bào)道較少。

為解決噬菌體宿主譜窄的問(wèn)題，本研究[19]將前期分離到的一株ETEC噬菌體vB_EcoM_JS09（簡(jiǎn)稱JS09）與一株非宿主菌EHEC O157∶H7 47共培養(yǎng)，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)體系和條件，經(jīng)過(guò)多輪共培養(yǎng)篩選到了能同時(shí)裂解ETEC和EHEC O157∶H7菌株的噬菌體，拓寬了親本噬菌體JS09的宿主譜，建立了一種拓寬噬菌體宿主譜的方法，并進(jìn)一步研究了裂解性較好的寬宿主譜噬菌體Bp47-12的生物學(xué)特性和裂解特性。

1 材料與方法

1.1 菌株、噬菌體與試劑噬菌體vB_EcoM_JS09（簡(jiǎn)稱JS09，GenBank登錄號(hào)：KF582788）由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；ETEC EK99-F41菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；EHEC O157∶H7 47菌株來(lái)源于牛，EHEC O157∶H7 86-24菌株來(lái)源于人，EHEC O157∶H7 363菌株來(lái)源未知，以上菌株均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)所贈(zèng)與；EHEC O157∶H7 012和027菌株來(lái)源于豬，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)所王少輝贈(zèng)與；LB培養(yǎng)基購(gòu)自海博（青島）生物技術(shù)有限公司。

1.2 噬菌體的培養(yǎng)挑取ETEC EK99-F41的單個(gè)菌落接種于4 mL液體LB中，于37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得到宿主菌濃度約為1×109CFU/mL。取EK99-F41菌液（1×109CFU/mL）150 μL加入噬菌體JS09純培養(yǎng)液（1×1010PFU/mL）200 μL中，室溫靜置吸附15 min，加入10 mL液體LB培養(yǎng)基，37℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)6 h，于4℃條件下11 269 ×g離心10 min，收集上清，0.22 μm濾膜過(guò)濾，并保存于4℃。

1.3 噬菌體宿主譜的拓寬方法按照MOI為100的比例，取1 mL噬菌體JS09（1×1010PFU/mL）與 100 μL EHEC O157∶H7 47（1×109CFU/mL）充分混合，室溫靜置吸附15 min后，進(jìn)行雙層瓊脂平板試驗(yàn)，加入3.5 mL 55℃左右的0.6%瓊脂LB培養(yǎng)基，迅速混勻倒入1.2%瓊脂LB平板上，凝固后37℃培養(yǎng)12 h，共3個(gè)雙層瓊脂平板。

1.4 寬宿主譜噬菌體的分離與純化標(biāo)記雙層瓊脂平板上的典型噬菌斑，分別編號(hào)，用槍頭分別移取噬菌斑于500 μL LB培養(yǎng)液中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)8 h。選取液體澄清的編號(hào)樣品，進(jìn)行下一步擴(kuò)大培養(yǎng)。

取上述樣品，全部與100 μL EHEC O157∶H7 47（1×109CFU/mL）混合，室溫靜置吸附15 min后，接入5 mL LB培養(yǎng)液中。37℃靜置培養(yǎng)6 h，選取液體澄清的樣品，7826×g離心10 min，取上清液，0.22 μm濾膜過(guò)濾，保存于4℃。分別測(cè)定單一噬菌斑，重復(fù)該純化操作3～5次即得純化噬菌體。

1.5 噬菌體宿主譜的點(diǎn)樣試驗(yàn)通過(guò)點(diǎn)樣試驗(yàn)分析純化的噬菌體宿主譜[19]，當(dāng)噬菌體能夠裂解細(xì)菌時(shí)會(huì)出現(xiàn)抑菌圈，統(tǒng)計(jì)噬菌體對(duì)各細(xì)菌的裂解情況得到該噬菌體的宿主譜（表1）。

1.6 寬宿主譜噬菌體噬菌斑形態(tài)分析參照1.3中的雙層瓊脂平板試驗(yàn)方法，將篩選到的裂解效果較好的寬宿主譜噬菌體Bp47-12，以EHEC O157∶H7 363為宿主菌進(jìn)行雙層瓊脂平板試驗(yàn)。

1.7 寬宿主譜噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）的測(cè)定 取對(duì)數(shù)期宿主菌EHEC O157∶H7 363，按不同感染復(fù)數(shù)1∶1000、1∶100、1∶10、1∶1、10∶1、100∶1加入噬菌體Bp47-12和宿主菌EHEC O157∶H7 363，37℃、 150 r/min振蕩培養(yǎng)5 h，4℃、10 000×g離心10 min，得上清液測(cè)定各組噬菌體效價(jià)。試驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)置不加噬菌體的宿主菌培養(yǎng)液為試驗(yàn)對(duì)照。

1.8 寬宿主譜噬菌體一步生長(zhǎng)曲線繪制參考Leuschner等[20]的方法，取對(duì)數(shù)期宿主菌EHEC O157∶H7 363，以MOI≥10加入噬菌體Bp47-12，37℃水浴15 min，10 000×g離心1 min，去上清，LB液洗滌2次，細(xì)菌沉淀加入37℃預(yù)熱的LB液中混勻，迅速于37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)。每10 min取樣測(cè)噬菌體效價(jià)，設(shè)立不加噬菌體的宿主菌培養(yǎng)液和不加宿主菌的噬菌體作為試驗(yàn)對(duì)照。以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，噬菌體效價(jià)對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制一步生長(zhǎng)曲線，試驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)2個(gè)平行。

1.9 寬宿主譜噬菌體吸附曲線分析培養(yǎng)過(guò)夜細(xì)菌EHEC O157∶H7 363（接種一個(gè)單菌落到5 mL LB中，37℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)），取0.5 mL該菌液加入到10 mL LB中，此時(shí)細(xì)菌濃度約為2×108CFU/mL，再置于37℃振蕩培養(yǎng)60 min。用LB稀釋噬菌體Bp47-12，制備10 mL效價(jià)為2×105PFU/mL的噬菌體Bp47-12（稀釋好后測(cè)定噬菌體效價(jià)）；將步驟培養(yǎng)的細(xì)菌與制備好的噬菌體充分混合，搖勻后立即取1 mL樣品，于4℃、15 000×g離心1 min，取上清測(cè)定噬菌體效價(jià)；按照以上取樣方法，每隔5 min取樣測(cè)定噬菌體效價(jià)至30 min，重復(fù)3次取平均值，繪制吸附曲線。

1.10 寬宿主譜噬菌體酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性測(cè)定配 制pH值分別為2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13的蛋白胨水，取不同pH值的蛋白胨水與噬菌體Bp47-12等量混合，37℃水浴2 h后測(cè)定效價(jià)；取100 μL噬菌體于離心管中，測(cè)定初始效價(jià)，將離心管分別置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的水浴環(huán)境中作用30 min和60 min，測(cè)定噬菌體效價(jià)變化。兩個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3次，每次設(shè)2個(gè)平行，取平均值。

1.11 寬宿主譜噬菌體體外裂解特性分析分別取過(guò)夜培養(yǎng)的EHEC O157∶H7 363，EHEC O157∶H7 47和ETEC EK99-F41菌液，用LB將其OD600值調(diào)整為0.86（約為2.5×106CFU/mL）左右，以MOI為10的比例加入噬菌體Bp47-12并至終濃度為1×107PFU/mL，于37℃靜置培養(yǎng)，同時(shí)以不加噬菌體作為對(duì)照組。在培養(yǎng)的0～5 h，每1 h檢測(cè)一次OD600值的變化。

2 結(jié)果

2.1 寬宿主譜噬菌體的分離純化及其宿主譜分析噬菌體JS09與EHEC O157∶H7 47共培養(yǎng)后，以EHEC O157∶H7 47為宿主菌，在3個(gè)雙層瓊脂平板上共生長(zhǎng)了12個(gè)較小的噬菌斑。對(duì)12個(gè)噬菌斑分別進(jìn)行3次重復(fù)分離純化后，最終篩選到能夠使EHEC O157∶H7 47菌液由渾濁變澄清的寬宿主譜噬菌體，分別命名為Bp47-1、Bp47-2、Bp47-3、Bp47-8、Bp47-9和Bp47-12。

通過(guò)點(diǎn)樣試驗(yàn)觀察LB培養(yǎng)平板上是否出現(xiàn)抑菌圈，結(jié)果可知，對(duì)照組噬菌體JS09僅能夠裂解ETEC EK99-F41，而噬菌體Bp47-1、Bp47-2、Bp47-3、Bp47-8、Bp47-9和Bp47-12不僅能裂解ETEC EK99-F41，而且能裂解EHEC O157∶H7 47、363、86～24（圖1），以及從臨床分離的豬源EHEC O157：H7菌株012和027（重復(fù)3代噬菌體以上）（表1）。

圖1 噬菌體JS09、Bp47-1、Bp47-2、Bp47-3、Bp47-8、Bp47-9 和Bp47-12 原液?jiǎn)螌悠桨妩c(diǎn)樣試驗(yàn)Fig.1 Spot tests of phages JS09, Bp47-1, Bp47-2, Bp47-3, Bp47-8, Bp47-9 and Bp47-12 in the liquid samples

表1 噬菌體的宿主譜Table 1 Host range of phages

2.2 寬宿主譜噬菌體的噬菌斑形態(tài)選取裂解效果較好的寬宿主譜噬菌體Bp47-12，以EHEC O157∶H7 363為宿主菌，雙層瓊脂平板試驗(yàn)表明，噬菌體Bp47-12在平板上均呈現(xiàn)出了典型裂解性噬菌體特征，空斑透亮，邊緣整齊清晰，無(wú)暈環(huán)噬菌斑（圖2）。

2.3 寬宿主譜噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)噬菌體Bp47-12在MOI為1∶1時(shí)，宿主菌EHEC O157∶H7 363釋放的子代噬菌體效價(jià)為5.5×108PFU/mL，在各試驗(yàn)組中最高，為噬菌體擴(kuò)增時(shí)的最佳MOI值（表2）。

2.4 寬宿主譜噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線噬菌體Bp47-12感染宿主菌EHEC O157∶H7 363的潛伏期約 30 min，爆發(fā)持續(xù)時(shí)間約70 min，根據(jù)爆發(fā)末期的噬菌體效價(jià)和感染初期的宿主菌濃度算得平均爆發(fā)量為15（平均爆發(fā)量=爆發(fā)末期的噬菌體效價(jià)/感染初期的宿主菌濃度）（圖3）。

2.5 寬宿主譜噬菌體的吸附曲線吸附曲線表明，在37℃時(shí)噬菌體Bp47-12在25 min內(nèi)能夠完全吸附到宿主菌EHEC O157∶H7 363表面（圖4）。

2.6 寬宿主譜噬菌體的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性測(cè)定噬菌體Bp47-12在各溫度下作用30、60 min后效價(jià)變化無(wú)太大差別，30℃、40℃、50℃、60℃下幾乎維持在初始時(shí)的效價(jià)，但70℃時(shí)下降較快，80℃之后已基本無(wú)噬菌體存在（圖5A）。

噬菌體Bp47-12在pH3～9范圍內(nèi)效價(jià)較穩(wěn)定，pH值小于3以及大于9噬菌體效價(jià)都會(huì)明顯降低，pH≤2或≥10時(shí)基本檢測(cè)不到噬菌斑，表明此時(shí)大部分噬菌體已經(jīng)失活（圖5B）。

2.7 寬宿主譜噬菌體的體外裂解特性加入噬菌體Bp47-12至菌液作用1 h后，Bp47-12組OD600值由0.86降至0.66左右；2 h后，該組OD600值仍在下降，肉眼可觀察到菌液明顯較對(duì)照組澄清；作用5 h后，Bp47-12組的OD600值降至0.20左右，下降了約0.66個(gè)OD600值，此時(shí)菌液變得較為透亮且澄清，而對(duì)照組OD600值仍在上升，達(dá)到1.4以上，上升了約0.55個(gè)OD600值，且菌液較為混濁（圖6A、6B）。

當(dāng)宿主菌為ETEC EK99-F41時(shí)，加入噬菌體Bp47-12至菌液作用2 h后，Bp47-12組OD600值開(kāi)始下降，在5 h時(shí)OD600值降至0.20左右（圖6C），因此，當(dāng)MOI為10時(shí)，噬菌體Bp47-12能夠有效裂解EHEC O157∶H7 363，EHEC O157:H7 47和ETEC EK99-F41。

圖2 寬宿主譜噬菌體Bp47-12 雙層瓊脂平板試驗(yàn) Fig.2 Bp47-12 with expanded host range in double layer agar plate

表2 噬菌體Bp47-12 的最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定Table 2 Determination of optimal MOI of Bp47-12

圖3 噬菌體Bp47-12 一步生長(zhǎng)曲線 Fig.3 One-step growth curve of Bp47-12

圖4 噬菌體Bp47-12 吸附曲線Fig.4 Adsorption curve of Bp47-12

3 討論

噬菌體是地球上最豐富和具有多樣性的生物體，大約有1032個(gè)有尾噬菌體[21-22]。隨著抗生素在畜牧養(yǎng)殖業(yè)和醫(yī)學(xué)上的使用，抗生素耐藥性已經(jīng)成為一個(gè)危害全世界公共健康的問(wèn)題，大腸桿菌中耐多粘菌素MCR-1（plasmid-mediated colistin resistance）耐藥基因的發(fā)現(xiàn)，標(biāo)志著細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性已突破最后一道防線[23]。近年來(lái)，將噬菌體應(yīng)用于畜牧獸醫(yī)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，已受到全球科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)的重視。裂解性噬菌體雖能夠特異性侵染并裂解細(xì)菌，但從自然界中分離的裂解性噬菌體宿主譜較窄[24]，盡管有研究者通過(guò)分離寬宿主譜噬菌體、改造噬菌體基因組以及混合多種噬菌體等方法來(lái)改變或擴(kuò)大噬菌體的宿主譜和裂解特性，但這些方法比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力[18,24]。

圖5 噬菌體Bp47-12 對(duì)溫度(A)及酸堿度(B)的耐受能力Fig.5 Resistance of Bp47-12 to temperature (A), acid and alkali (B)

圖6 噬菌體Bp47-12 的體外裂解特性分析 Fig.6 In vitro lytic assay of Bp47-12

由于非宿主菌對(duì)噬菌體不敏感，本研究在前期分離的親本ETEC噬菌體JS09基礎(chǔ)上，建立了一種簡(jiǎn)便的擴(kuò)大噬菌體宿主譜的方法。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)提高M(jìn)OI的比例將效價(jià)較高的噬菌體與非宿主菌共培養(yǎng)能夠有利于篩選到寬宿主譜噬菌體。噬菌體的生存離不開(kāi)細(xì)菌，噬菌體在細(xì)菌的進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[24]，噬菌體的宿主特異性不是一成不變的，噬菌體與細(xì)菌在生長(zhǎng)循環(huán)過(guò)程中相互作用共進(jìn)化，這種互相作用受到環(huán)境條件和整體模式的影響，使得噬菌體或細(xì)菌能夠發(fā)生適應(yīng)性變異[25]。因此推測(cè)，在特定的生長(zhǎng)條件和選擇壓力下，可促使親本噬菌體的宿主特異性發(fā)生變化。

噬菌體的宿主譜由噬菌體在感染過(guò)程中受體結(jié)合蛋白與宿主菌的受體蛋白相互作用決定[2]。有尾噬菌體T4通過(guò)尾絲蛋白識(shí)別宿主受體，包括長(zhǎng)尾絲蛋白和短尾絲蛋白[26]。研究表明，通過(guò)改變長(zhǎng)尾絲蛋白基因的His box序列能夠拓寬T4噬菌體的宿主 譜[27]。與親本噬菌體JS09相比，噬菌體Bp47-12的短尾絲蛋白基因序列發(fā)生改變（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）可能導(dǎo)致宿主譜的拓寬，對(duì)此機(jī)制的研究仍在進(jìn)行中。通過(guò)改變宿主受體結(jié)合蛋白基因能夠改變噬菌體宿主譜，Yoichi等[28]利用同源重組技術(shù)將T2噬菌體宿主受體識(shí)別基因gp37和gp38替換為EHEC O157∶H7特異性噬菌體pp01的gp37和gp38，構(gòu)建了一株重組噬菌體T2ppD1，該重組噬菌體能夠侵染大腸桿菌O157∶H7及其近緣屬種，但是不能侵染原宿主菌大腸桿菌K12或其衍生菌。

借助于噬菌體與宿主菌共進(jìn)化，將噬菌體與非特異性細(xì)菌共同培養(yǎng)，以期拓寬噬菌體的宿主譜，此技術(shù)無(wú)需繁瑣耗時(shí)的基因操作。Mapes等[24]通過(guò)將噬菌體與多株耐藥性不同的銅綠假單胞菌經(jīng)過(guò)幾輪共培養(yǎng)，拓寬了銅綠假單胞菌特異性噬菌體的宿主譜，并能夠有效抑制銅綠假單胞菌形成的生物膜。EHEC O157∶H7導(dǎo)致的食品污染和腹瀉嚴(yán)重威脅著人類健康[5]。研究表明，EHEC O157∶H7噬菌體主要應(yīng)用于食品和食品加工器械表面的消毒，以及動(dòng)物體內(nèi)的殺菌試驗(yàn)[29]。在37℃條件下，pp01、e11/2和e4/1c三種噬菌體混合制劑能夠有效地去除肉類中的EHEC O157∶H7[30]。因此，本研究中篩選的能夠裂解EHEC O157∶H7的寬宿主譜噬菌體具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本研究建立的拓寬噬菌體宿主譜的方法和分離到的寬宿主譜噬菌體Bp47-12能夠同時(shí)裂解ETEC和EHEC O157∶H7菌株，因此具有潛在的應(yīng)用價(jià)值和一定的研究意義，同時(shí)也為拓寬裂解性噬菌體宿主譜和應(yīng)用噬菌體提供科學(xué)依據(jù)和可行性。