姜程耀，林松毅,2，李冬梅,2，楊睿雯，孫 娜,2,

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034；3.吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130062）

葵花籽是一種重要的油料作物，我國葵花籽資源豐富，主要用于制油?？ㄗ阎朴秃螽a(chǎn)生的副產(chǎn)物——葵花籽粕富含30%的優(yōu)質(zhì)蛋白[1]，其必需氨基酸的含量（除賴氨酸外）均高于或接近聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織推薦值[2]，可作為天然植物蛋白的重要來源，也是生物活性肽的良好來源，如抗菌肽[3]、抗氧化肽[4]、降壓肽[5-6]。然而，目前葵花籽粕利用率不高，多用作飼料或直接拋棄。因此，有效利用葵花籽副產(chǎn)物對于葵花籽高值化利用是十分必要的。

輻照是一種常用于食品保鮮和改變食品特性的方法[7]，通過輻照使食品暴露于非電離和電離狀態(tài)以破壞食物中的微生物、病毒或細菌的結(jié)構(gòu)，從而達到殺菌的效果，輻照還能改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而改變其特性[8]。輻照技術(shù)多應(yīng)用于食物殺菌，目前研究者也逐漸關(guān)注其在改變蛋白質(zhì)特性方面的應(yīng)用[9-12]。有研究通過γ射線照射大豆蛋白，原蛋白的結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白降解成多肽，多肽重新交聯(lián)、凝聚。這被應(yīng)用于大豆豆粕和濃縮蛋白，γ射線照射提高了豆粕和濃縮蛋白的性能[11]。電子束輻照是輻照技術(shù)的一種，與其他輻照技術(shù)相比，電子束輻照不產(chǎn)生輻射廢料且無危險，能夠在短時間內(nèi)產(chǎn)生高能量，并且利用率高、成本低。利用電子束輻照能夠改變蛋白的性能，使其可以被廣泛地應(yīng)用[12]。研究發(fā)現(xiàn)電子束輻照可以改善蛋清蛋白粉、核桃蛋白粉、玉米粉的特性，如熱穩(wěn)定性、水解性、抑制凝膠特性[13-15]。關(guān)于電子束輻照對葵花籽蛋白性能的影響，目前尚鮮有報道。

本研究采用脫脂后的葵花籽粕為原料，通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察電子束輻照對葵花籽蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響，利用低場核磁、激光粒度儀進一步探究電子束輻照對葵花籽蛋白特性的影響和形成原因，為葵花籽粕的高值化利用和電子束輻照的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂葵花籽：壓榨法提油后剩余的部分，蛋白質(zhì)量分數(shù)約為30.75%，水分質(zhì)量分數(shù)為8.3%。

Alcalase FG 2.4 L堿性蛋白酶（酶活力為170 000 U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；三氟乙酸（色譜純） 美國Sigma公司；乙腈（色譜純） 美國Spectrum化學(xué)試劑公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LCQ液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源及Xcalibur1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國Finnigan公司；1100高效液相色譜系統(tǒng)（配有可變波長紫外檢測器和 Rev.A.06.03色譜工作站） 美國惠普公司；10 MeV/15 kW輻照電子直線加速器 長春易孚輻照加速器有限公司； JSM-6700F場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本電子日株式會社；E-1045型離子濺射儀 日本日立高新技術(shù)有限公司；Zetasizer nano ZS90激光粒度儀 英國Malvern儀器有限公司；NMI20-030H-1核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）成像分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；ESJ60-4電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DK-8D恒溫水浴槽 上海精宏試驗設(shè)備有限公司；Starter-300便攜式pH計 上海奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葵花籽蛋白電子束輻照

參考林松毅等[16]的方法，用高速粉碎機將脫脂葵花籽打碎成粉，過100 目篩，稱取100 g脫脂葵花籽粉放入塑料自封袋，壓平，放入電子束輻照室，輻照采用10 MeV/15 kW電子加速器，樣品在室溫下進行輻照，劑量率為0.5 kGy/h，輻照時間分別為5、10、15、20 h，對應(yīng)的輻照劑量分別為2.5、5.0、7.5、10.0 kGy，經(jīng)過電子束輻照后將樣品放入－80 ℃冰箱保存。

1.3.2 掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)

參考Sun Na等[17]的方法對電子束輻照處理前后的葵花籽蛋白粉進行電子顯微鏡掃描。將潔凈的鋁箔片粘附于樣品臺上，稱取1 mg葵花籽粉樣品置于鋁箔片上，將樣品臺置于離子濺射儀的樣品艙中，在15 mA的電流下噴金90 s，將樣品臺裝入電子顯微鏡觀察室，焦距調(diào)至600、2 000 倍，選取清晰視野進行觀察。

1.3.3 LF-NMR分析

參考Lin Songyi等[18]的方法對樣品進行低場核磁（low field-NMR，LF-NMR）分析。稱取經(jīng)不同輻照處理的樣品2.5 g溶于25 mL蒸餾水中，取3 mL溶液放入玻璃瓶中，將玻璃瓶至直徑為10 mm的核磁管中進行檢測，利用CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈沖序列測定樣品的自旋-自旋弛豫時間（T2）。采樣參數(shù)：采用的射頻線圈直徑為60 mm，中心頻率為22 MHz，采樣點數(shù)為1 984 972，質(zhì)子共振頻率為22 Hz，CPMG序列測定T2弛豫時間，半回聲時間（90°脈沖到100°脈沖的時間）為0.6 ms。

1.3.4 葵花籽肽粉的制備與分析

參考Lin Songyi等[19]的方法，將輻照后的葵花籽粉溶于蒸餾水中，得到質(zhì)量濃度為5 g/100 mL的溶液，在90 ℃保溫10 min，冷卻至45 ℃，加入1 mmol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8，并保持pH值穩(wěn)定，加入3 000 U/g堿性蛋白酶水解3 h（保持pH值恒定），將pH值調(diào)至中性，在90 ℃水浴下滅酶10 min。冷卻至室溫，10 000 r/min離心15 min，取上清液，將所得的上清液冷凍干燥后所得物質(zhì)即為葵花籽蛋白肽粉。

水解度參考文獻[20]采用pH-stat法測定，以滴定葵花籽蛋白肽所消耗的標(biāo)準NaOH溶液體積，按照公式（1）計算水解度[20]。

式中：V表示維持pH值恒定為8所消耗的NaOH的體積/mL；c表示NaOH的濃度/（mmol/L）；m表示被水解的蛋白質(zhì)量/g；hmt表示蛋白質(zhì)中肽鍵的總數(shù)/（mmol/g）；α表示水解過程中葵花籽蛋白中的α-氨基的解離度，具體按公式（2）計算。

式中：pH表示當(dāng)前溶液的pH值；pK表示水解過程中釋放的α-氨基的平均解離度，取決于溫度、肽鏈長度和末端氨基酸的性質(zhì)。

參考Lin Songyi等[21]的方法，采用激光粒度儀測定樣品肽的粒度，每份樣品測定3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，采用獨立樣品的t檢驗進行差異顯著性分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準差表示，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量輻照的葵花籽蛋白粉微觀結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

由圖1所示，未經(jīng)過輻照的葵花籽蛋白粉形狀完整，表面圓潤光滑，邊界明顯；經(jīng)2.5 kGy輻照后，表面開始出現(xiàn)凹凸不平，但仍然保持完整的顆粒結(jié)構(gòu)；當(dāng)輻照量增至5.0 kGy后，樣品表面破碎、凹凸不平。當(dāng)輻照強度達到7.5 kGy時，樣品表面完整性遭到破壞，邊界不明顯，呈破碎狀。研究結(jié)果與Jin Yan[14]、Xue Peiyu[15]等的報道結(jié)果一致，說明輻照會改變蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)，破壞其表面結(jié)構(gòu)完整性，而且輻照劑量越大，破壞程度越高。Lee等[22]發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象與蛋白分子和氧自由基的相互作用有關(guān)，輻照會使水產(chǎn)生氧自由基，氧自由基可以促進蛋白表面發(fā)生斷裂，從而使蛋白更易破碎。

圖 1 不同劑量輻照后的葵花籽蛋白粉的掃描電子顯微鏡圖Fig. 1 Scanning electron microphotographs of sunflower seed protein powder irradiated by different doses of EBI

2.2 不同劑量輻照后的葵花籽蛋白粉的LF-NMR結(jié)果

圖 2 經(jīng)不同輻照劑量處理的葵花籽蛋白粉的LF-NMR圖譜Fig. 2 LF-NMR curves of sunflower seed protein powder irradiated by different doses of EBI

LF-NMR是一種新型的無損檢測技術(shù)，通過T2弛豫時間的變化能夠推測蛋白結(jié)構(gòu)的變化。由圖2可以看出，根據(jù)弛豫時間的不同可分為3 種氫質(zhì)子組分，包括結(jié)合水、吸附水、自由水[23]。結(jié)合水是指與蛋白分子緊密結(jié)合的水，在圖中對應(yīng)弛豫時間為1～5 ms，用T21表示；吸附水是指與蛋白分子表面結(jié)合的水，在圖中對應(yīng)弛豫時間為10～90 ms，用T22表示；自由水是指蛋白質(zhì)分子周圍的游離水，在圖中對應(yīng)弛豫時間為100～1 000 ms，用T23表示，相應(yīng)峰面積可以表征對應(yīng)水分含量。弛豫時間和振幅隨著輻照劑量的變化而變化。

圖 3 經(jīng)不同輻照劑量處理的葵花籽蛋白粉的結(jié)合水、吸附水、 自由水峰面積Fig. 3 Peak area of bound water, adsorbed water and free water of sunflower seed protein powder irradiated by different doses of EBI

圖 4 經(jīng)不同輻照劑量處理的葵花籽蛋白粉總水峰面積Fig. 4 Peak area of total water of sunflower seed protein powder irradiated by different doses of EBI

從圖3可以看出，葵花籽蛋白粉中主要成分為自由水，其次是結(jié)合水和吸附水，與未經(jīng)輻照處理的葵花籽蛋白粉相比，經(jīng)輻照處理的葵花籽蛋白粉的自由水含量有降低的趨勢，但無顯著性差異（P＞0.05）；總水分含量發(fā)生顯著降低（P＜0.05），且不同輻照劑量處理的葵花籽蛋白粉之間總水分含量無顯著性差異（P＞0.05）（圖4）。結(jié)果表明，輻照處理可以降低葵花籽蛋白粉的水分含量。Schmid等[24]研究表明輻照可以使蛋白聚集和交聯(lián)，不同劑量的輻照產(chǎn)生不同的能量，由此導(dǎo)致蛋白產(chǎn)生不同程度的變性、聚集，使水分含量降低。

2.3 輻照對葵花籽蛋白水解度的影響

用蛋白酶水解蛋白是獲得活性多肽的主要途徑，水解度是衡量蛋白水解情況的重要指標(biāo)[25]。本研究采用堿性蛋白酶水解葵花籽蛋白，分析不同輻照劑量對葵花籽蛋白水解度的影響，其水解度如圖5所示。隨著水解時間的延長，未輻照和輻照后的葵花籽蛋白的水解度均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。同一水解時間，0～5.0 kGy葵花籽蛋白的水解度無顯著差異（P＞0.05），而輻照強度7.5～10.0 kGy組葵花籽蛋白的水解度顯著高于0～5.0 kGy處理組（P＜0.05）。水解180 min時，未經(jīng)電子束輻照的葵花籽蛋白的水解度為19.33%，7.5 kGy輻照處理使葵花籽蛋白的水解度增加到了24.67%，說明高于7.5 kGy劑量的電子束輻照可促進葵花籽蛋白的水解。本研究結(jié)果與Jin Yan[14]、Bak[26]、Karthika[27]等的結(jié)果一致，即電子束輻照可以增強蛋清蛋白、稻秸、木質(zhì)纖維素的水解?？赡苁怯捎谳椪债a(chǎn)生的自由基破壞了底物的結(jié)構(gòu)，使多肽鏈斷裂，增加了酶與底物的接觸面積，促進了酶解反應(yīng)的進行[28]。結(jié)合掃描電子顯微鏡、LF-NMR結(jié)果，7.5 kGy劑量的電子束輻照破壞了葵花籽蛋白粉的表面結(jié)構(gòu)完整性，增強了其水解特性。

圖 5 經(jīng)不同輻照劑量處理的葵花籽蛋白的水解度Fig. 5 Hydrolysis degree of sunflower seed protein irradiated by different doses of EBI

2.4 不同輻照劑量的葵花籽蛋白肽的粒徑分析結(jié)果

圖 6 經(jīng)不同輻照劑量處理的葵花籽蛋白肽的粒徑Fig. 6 Particle sizes of sunflower seed peptide irradiated by different doses of EBI

將不同劑量輻照后的葵花籽蛋白粉進行酶解后，采用激光粒度儀測定葵花籽蛋白肽粒徑大小。由圖6可知，與未經(jīng)輻照處理的樣品相比，當(dāng)輻照劑量小于5 kGy時，經(jīng)過輻照處理的葵花籽蛋白肽的粒徑?jīng)]有發(fā)生顯著性變化（P＞0.05），輻照劑量由5.0 kGy增加至7.5 kGy時，葵花籽蛋白肽的粒徑顯著降低（P＜0.05），由（490.4±20.8）nm降低至（263.3±39.2）nm。本研究結(jié)果與葵花籽蛋白的水解度變化趨勢一致，輻照劑量達到7.5 kGy時，葵花籽蛋白的水解度最高，產(chǎn)生的蛋白肽粒徑最小，10.0 kGy處理組粒徑與7.5 kGy處理組粒徑差異不顯著（P＞0.05）；說明高于7.5 kGy劑量的輻照處理促進葵花籽蛋白的酶解反應(yīng)，使其水解產(chǎn)生粒度更小的肽。同樣地，Morales等[29]也發(fā)現(xiàn)輻照會引起粒度分布的變化。Lee等[30]報道過輻照會使蛋白構(gòu)象產(chǎn)生不可逆的變化，包括斷裂、聚集或交聯(lián)。結(jié)合掃描電子顯微鏡結(jié)果，說明電子束輻照可能造成蛋白斷裂，經(jīng)酶解后產(chǎn)生粒度更小的肽。

3 結(jié) 論

本研究采用電子束輻照技術(shù)對葵花籽蛋白進行非熱加工處理，發(fā)現(xiàn)輻照會改變葵花籽蛋白微觀結(jié)構(gòu)，破壞其表面結(jié)構(gòu)完整性，造成穿孔和破碎，而且輻照劑量越大，破壞程度越高。經(jīng)2.5 kGy輻照后葵花籽蛋白粉表面出現(xiàn)很多孔隙，開始變得凹凸不平，但仍然保持完整的顆粒結(jié)構(gòu)；當(dāng)輻照強度達到7.5 kGy時，樣品表面完整性遭到破壞，邊界不明顯，呈破碎狀。然而，輻照劑量達到7.5 kGy以上時，葵花籽蛋白的水解度增加，促進其水解產(chǎn)生粒度更小的葵花籽蛋白肽，說明電子束輻照提高了葵花籽蛋白的水解特性。本研究結(jié)果為電子束輻照在改善蛋白質(zhì)性能方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。