姜 靜，杜仁鵬，郭尚旭，趙 丹,

（1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150080）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞壁外的一種天然高分子聚合物，具有分子質(zhì)量大、黏度大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣等特點(diǎn)[1]。乳酸菌具有公認(rèn)安全無(wú)毒的特性，廣泛用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域[2]。 乳酸菌EPS具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和降血糖等功能，具有開(kāi)發(fā)成益生元的潛力，還可以作為增稠劑、穩(wěn)定劑等改善或增強(qiáng)乳制品的口感和流變學(xué)特性[3]。

根據(jù)合成位置不同，乳酸菌EPS可以分為莢膜多糖（capsular polysaccharides，CPS）和黏多糖（slime polysaccharides，SPS），但這兩種多糖因?yàn)榻Y(jié)合在一起很難區(qū)分而統(tǒng)稱為EPS。從化學(xué)組成上，乳酸菌EPS可分為同型多糖（homopolysaccharides，HoPS）和異型多糖（heteropolysaccharides，HePS）[4]。能夠產(chǎn)EPS的乳酸菌主要包括：鏈球菌屬（Streptococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和明串珠菌屬（Leuconostoc）等[5]。研究表明，由于菌種來(lái)源、培養(yǎng)條件和分離純化方法等不同，使得EPS的分子質(zhì)量、單糖組成、結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大差異，進(jìn)而影響EPS的功能特性。此外，由于乳酸菌EPS的產(chǎn)量較低，提取成本相對(duì)較高，無(wú)法滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的需求。目前高產(chǎn)乳酸菌EPS菌種資源相對(duì)匱乏，從而限制其廣泛的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。傳統(tǒng)發(fā)酵食品被認(rèn)為是分離具有特殊功能特性物質(zhì)最好的來(lái)源[6]。因此，分離篩選能夠穩(wěn)定產(chǎn)生EPS的乳酸菌，并通過(guò)優(yōu)化提高EPS的產(chǎn)量，進(jìn)而分離純化EPS，明確其理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)，為解析EPS結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)EPS產(chǎn)品提供參考，具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)利用微生物學(xué)方法從自制發(fā)酵水果中分離篩選高產(chǎn)EPS的乳酸菌，并對(duì)EPS進(jìn)行分離純化，研究其部分理化性質(zhì)，其結(jié)果不僅豐富了EPS菌株來(lái)源，還可以為EPS的功能特性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東北甜瓜購(gòu)自哈爾濱南崗哈達(dá)批發(fā)市場(chǎng)。

質(zhì)粒小量提取試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 TIANGAN股份有限公司；API 50 CHL鑒定試劑條 法國(guó)生物梅里埃公司。

MRS培養(yǎng)基（100 mL）：葡萄糖2 g、酵母提取物0.5 g、牛肉膏1 g、胰蛋白胨1 g、K2HPO40.2 g、檸檬酸銨0.2 g、無(wú)水乙酸鈉0.5 g、MnSO4g H2O 0.025 g、MgSO4g 7H2O 0.058 g、吐溫-80 0.1 mL，用于乳酸菌的的活化及培養(yǎng)；產(chǎn)糖培養(yǎng)基（MRS-S）：用蔗糖取代MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha-1900Plus紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海譜元儀器有限公司；BX43生物顯微鏡 奧林巴斯（深圳）工業(yè)有限公司；SM20＋3140B體視鏡 北京泰克儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將200 g東北甜瓜切成小塊裝入無(wú)菌500 mL三角瓶中，向其加入300 mL無(wú)菌水，密封，于30 ℃條件下靜置5 d。

1.3.2 產(chǎn)EPS乳酸菌的分離

取2 mL水果發(fā)酵液，采用稀釋倒平板法[7]利用涂布棒將稀釋液均勻涂布于含CaCO3的MRS平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h后。挑取具有溶鈣圈的單菌落接種于30 mL MRS-S液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)36 h后，利用苯酚-硫酸法測(cè)定EPS質(zhì)量濃度，篩選得到高產(chǎn)EPS乳酸菌。

1.3.3 高產(chǎn)EPS乳酸菌的鑒定

利用體視鏡和顯微鏡觀察高產(chǎn)EPS乳酸菌的菌落和菌體形態(tài)特征。利用API 50 CHL鑒定試劑條鑒定菌株的糖發(fā)酵特性。以模式菌株Weissella hellenicaNCFB 2973（CGMCC 1.2513）為陽(yáng)性對(duì)照，鑒定高產(chǎn)EPS乳酸菌的生理生化特性[8]，如葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、氧化酶實(shí)驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、酯酶和脲酶實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、精氨酸水解實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法，提取高產(chǎn)EPS乳酸菌基因組DNA。以DNA為模板，按照Du Renpeng等[7]的方法，利用引物5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’和5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’[9]，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，利用DNA純化回收試劑盒回收目的片段并測(cè)序。測(cè)序所得的16S rDNA序列校對(duì)后，與美國(guó)國(guó)家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析，根據(jù)序列同源性，選取不同的菌株，采用MEGA 5.0軟件的UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定菌株的種屬關(guān)系。

1.3.4 EPS的分離及純化

將種子液以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種于300 mL產(chǎn)糖培養(yǎng)基中，30 ℃靜止培養(yǎng)48 h后，將發(fā)酵液于4 ℃、4 000hg條件下離心60 min，取上清液。根據(jù)Du Renpeng等[10]的方法，向上清液中加入3 倍體積預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，4 ℃過(guò)夜沉淀后，12 000hg離心收集沉淀，之后溶于50 mL去離子中，并加入10 g/100 mL三氯乙酸（50 mL），4 ℃充分?jǐn)嚢? h后，4 ℃、12 000hg離心40 min，去除蛋白沉淀。取上清液，向其中再次加入3 倍體積預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，過(guò)夜沉淀后，4 ℃、12 000hg離心40 min收集EPS沉淀，并溶于50 mL去離子中，將多糖溶液裝入截留分子質(zhì)量為14 000 Da的透析袋中，4 ℃透析2 d，每8 h換一次水。利用Sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析柱對(duì)透析后的樣品進(jìn)一步純化，上樣后，用流速為1 mL/min的去離子水在室溫下洗脫EPS，每5 mL收集一管，利用苯酚-硫酸法[11]測(cè)定EPS質(zhì)量濃度，合并含EPS的試管，冷凍干燥處理24 h，得到EPS純品。

1.3.5 總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定根據(jù)苯酚-硫酸法；蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定根據(jù)Bradford蛋白質(zhì)染料結(jié)合法[12]；糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定根據(jù)硫酸-咔唑法[13]。

1.3.6 EPS溶解性和持水力的測(cè)定

EPS溶解度的測(cè)定參照Wang Zhaomei等[14]的方法并作適當(dāng)?shù)母膭?dòng)。稱取45 mg EPS置于2 mL離心管中，加入0.5 mL超純水，在漩渦振蕩器上振蕩2 h使EPS充分溶解。12 000hg離心40 min沉降未溶解部分，收集沉淀冷凍干燥，稱質(zhì)量。

多糖持水率（water holding capacity，WHC）參照Wang Ji等[15]的方法，并稍作改動(dòng)。將EPS研磨成粉末置于95 ℃烘箱中烘干4 h。準(zhǔn)確稱取45 mg EPS置于2 mL離心管中，加入0.5 mL去離子水，充分溶解EPS。12 000hg離心40 min沉降未溶解部分，收集未溶解部分用濾紙小心擦掉表面水分稱質(zhì)量，記為m1。將沉淀冷凍干燥后稱質(zhì)量，記為m2。WHC根據(jù)式（1）計(jì)算。

1.3.7 EPS乳化能力測(cè)定

根據(jù)Kanamarlapudi等[16]的方法，分別取2.5 mL汽油、柴油、煤油、椰子油、橄欖油、葵花油、大豆油、苯和己烷與2.5 mL 50 mg/mL的EPS溶液振蕩混勻，于4 ℃條件下靜置12 h后，利用游標(biāo)卡尺測(cè)定乳化層的高度，根據(jù)式（2）計(jì)算乳化率。

1.3.8 EPS抑菌能力測(cè)定

根據(jù)牛津杯實(shí)驗(yàn)[17]，以大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志賀氏菌（Shigella castellani）和銅綠假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）為指示菌，取100 μL質(zhì)量濃度為50 mg/mL和100 mg/mL的EPS溶液分別加入到抑菌孔中，在最適溫度下培養(yǎng)12 h后，利用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑。

1.3.9 抗氧化活性的測(cè)定

1.3.9.1 總還原力的測(cè)定

將不同質(zhì)量濃度的EPS溶液1 mL與磷酸鹽緩沖液2.5 mL和鐵氰化鉀溶液2.5 mL充分混合，50 ℃反應(yīng)20 min后，隨即加入三氯乙酸2.5 mL，4 000hg離心30 min。取上清液2.5 mL與FeCl3溶液0.5 mL和去離子水2.5 mL充分混勻，反應(yīng)10 min后，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定反應(yīng)混合物的OD700nm，以O(shè)D700nm表示總還原力[18]。

1.3.9.2 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

將不同質(zhì)量濃度EPS溶液1 mL與Tris-HCl緩沖液3 mL充分混勻，25 ℃靜置20 min后，加入鄰苯三酚溶液0.3 mL，充分混勻，25 ℃反應(yīng)5 min后，隨即加入濃鹽酸1 mL，混勻后，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定反應(yīng)混合物的O。根據(jù)公式（3）計(jì)算超氧陰離子自由基（）的清除能力。

式中：A0為加入鄰苯三酚后的吸光度；A1為終反應(yīng)吸光度；A2為只加入Tris-HCl緩沖液的吸光度。

1.3.9.3 羥自由基清除能力的測(cè)定

將不同質(zhì)量濃度EPS溶液1 mL和水楊酸-乙醇溶液1 mL以及FeSO4溶液1 mL充分混勻，之后再加入H2O2溶液1 mL，37 ℃靜置反應(yīng)40 min后，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定混合物的。根據(jù)公式（4）計(jì)算羥自由基（?OH）的清除能力。

式中：A0為以水為對(duì)照的吸光度；A1為與?OH反應(yīng)后的吸光度；A2為以水代替H2O2溶液的吸光度。

1.3.9.4 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

將不同質(zhì)量濃度的EPS溶液2 mL和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）-乙醇溶液2 mL充分混勻，于暗處反應(yīng)30 min后，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定反應(yīng)物的。根據(jù)公式（5）計(jì)算DPPH自由基的清除率。

式中：A0為以水為對(duì)照的吸光度；A1為與DPPH自由基反應(yīng)后的吸光度；A2為樣品溶液的吸光度，即以水代替DPPH溶液，排除樣品本身吸光度對(duì)結(jié)果的影響。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理均設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。利用JMP（Version 9.0.2）軟件進(jìn)行方差分析及多重比較，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的顯著水平設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)EPS乳酸菌的分離與鑒定

本研究從水果發(fā)酵液中共分離得到6 株利用蔗糖產(chǎn)生EPS的乳酸菌，其中菌株H2產(chǎn)EPS的質(zhì)量濃度高于其他5 株菌，在發(fā)酵液中的質(zhì)量濃度為（40.21f 3.63）g/L，并顯著高于W. confuseKR780676 EPS（17.2 g/L）[22]。在MRS培養(yǎng)基上，菌株H2的菌落為乳白色、不透明、凸起、近圓形、邊緣整齊、表面光滑。在MRS-S培養(yǎng)基上，菌落較大，表面附著大量黏性液體。顯微鏡下，該菌體呈串珠狀、無(wú)鞭毛、不運(yùn)動(dòng)、不產(chǎn)芽孢、革蘭氏染色陽(yáng)性。同模式菌株W. hellenicaNCFB 2973（CGMCC 1.2513）一樣，菌株H2能夠利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，氧化酶實(shí)驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、酯酶和脲酶實(shí)驗(yàn)、精氨酸水解實(shí)驗(yàn)、明膠液化、淀粉水解實(shí)驗(yàn)均呈陰性。API 50 CHL實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，通過(guò)對(duì)49 種碳水化合物的代謝情況分析，可以對(duì)細(xì)菌在種水平進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明該菌株的發(fā)酵特征與Weissella保持一致。16S rDNA序列分析表明，菌株H2部分序列長(zhǎng)為1 436 bp，與該序列相似性較高的相關(guān)菌株均為Weissella細(xì)菌。將菌株序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明該菌株與多株W. confuse基因序列的親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)到99%（圖1）。結(jié)合H2生物學(xué)特性和生理生化結(jié)果分析，將H2鑒定為W. confusa，并命名為W. confusaH2。將序列提交NCBI，獲得登錄號(hào)為MG560152.1。

表 1 菌株H2 API 50 CHL發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 API 50 CHL fermentation profiles of strain H2

圖 1 利用16S rDNA序列對(duì)菌株H2進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 1 Phylogenetic tree for H2 based on 16S rDNA sequences

2.2 EPS的分離純化及化學(xué)組成分析結(jié)果

表 2 H2 EPS純化結(jié)果Table 2 Purification of EPS from strain H2

H2發(fā)酵液經(jīng)離心除菌體、三氯乙酸去蛋白、乙醇沉淀EPS等步驟后，葡聚糖凝膠Sephadex G-100層析柱對(duì)粗EPS進(jìn)行純化，得到純EPS樣品，樣品洗脫圖展現(xiàn)出單一對(duì)稱峰，表明H2 EPS是一種分子質(zhì)量相對(duì)均一的組分，純度較高。如表2所示，經(jīng)純化后，H2 EPS的質(zhì)量濃度為（26.92f 2.15）g/L，得率為（66.95f 0.67）%。該EPS樣品在水中呈半透明黏稠狀，經(jīng)冷凍干燥后，呈現(xiàn)白色棉花狀固體。

總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（93.67f 2.08）%、 （0.32f 0.01）%和（6.01f 0.34）%。其中糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于Leu. mesenteroidesDRP105EPS[17]，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于Leu. pseudomesenteroidesGX-3 EPS[23]。

2.3 EPS溶解性、持水率及乳化性

表 3 H2 EPS對(duì)油類和烴類化合物的乳化能力Table 3 Emulsifying activity of H2 EPS with different vegetable oils and hydrocarbons

H2 EPS的溶解率和持水率分別為（98.78f 1.37）%和（426.03f 7.26）%，顯著高于Leu. pseudomesenteroidesYF32 EPS[24]和Leu. citreumB2 EPS[25]。持水率高通常溶解度也高，較高的吸水率和持水率是由于多糖復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，以及EPS中含有大量羥基的葡萄糖單元。

乳化劑能夠?qū)煞N不相溶解的液相體系在一定程度上進(jìn)行分散，更好地保持兩種溶劑間的穩(wěn)定性，在化學(xué)、食品、醫(yī)藥及石油等領(lǐng)域有十分廣泛的應(yīng)用[26]。如表3所示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，H2 EPS對(duì)有機(jī)溶劑的乳化作用增強(qiáng)，在24 h時(shí)，乳化率從大到小分別為己烷＞大豆油＞煤油＞葵花油＞苯＞汽油＞椰子油＞柴油＞橄欖油，其中對(duì)己烷和大豆油的乳化率分別為（78.28f 1.73）%和（73.23f 2.40）%。此結(jié)果與Streptococcus thermophilusCC30 EPS[16]和Lactobacillus rhamnosusEPS[27]一樣，均展現(xiàn)出良好的乳化能力。

2.4 EPS抑菌能力分析

表 4 H2 EPS的抑菌能力Table 4 Antibacterial activity of H2 EPS

以E. coli、Salmonella、St. aureus、S. castellani和P. aeruginosa為指示菌，考察H2 EPS的抑菌活性。如表4所示，H2 EPS具有良好的抑菌活性，對(duì)指示菌的抑制能力從大到小依次為P. aeruginosa＞E. coli＞S. castellani＞St. aureus，不能抑制Salmonella，且抑制能力隨著H2 EPS質(zhì)量濃度的升高而逐漸增強(qiáng)。Yu Youjin等[28]研究W. cibaria27 EPS的抑菌能力發(fā)現(xiàn)，該EPS同樣可以有效抑制P. aeruginosa、E. coli和St. aureus。研究表明，由于來(lái)源、分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)不同，使得EPS具有不同的抑菌特性，尤其是EPS中含有的硫酸鹽離子可以通過(guò)螯合作用吸附培養(yǎng)基中的金屬離子、微量元素及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使得指示菌因營(yíng)養(yǎng)條件匱乏而死亡[29]。因此可以看出，HD2 EPS具有良好的抑菌活性，具有開(kāi)發(fā)成生物防腐劑的潛力。在接下來(lái)的研究中，應(yīng)重點(diǎn)考察HD2 EPS的結(jié)構(gòu)，探究其抑菌機(jī)理。

2.5 H2 EPS的抗氧化活性

2.5.1 總還原力

圖 2 H2 EPS總還原力Fig. 2 Reducing power of H2 EPS

如圖2所示，隨著質(zhì)量濃度的升高，H2 EPS和VC的總還原力呈現(xiàn)先急速上升后穩(wěn)定的趨勢(shì)，但H2 EPS的總還原力始終低于VC。在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，H2 EPS的總還原力為1.32f 0.13，顯著高于Leu. mesenteroidesGX-3 EPS[23]和Pediococcus pentosaceusSR2-2 EPS[30]。研究表明，具有還原力的化學(xué)物質(zhì)可以提供氫原子來(lái)阻斷過(guò)氧化物的形成，進(jìn)而破壞自由基反應(yīng)鏈，展現(xiàn)抗氧化能力[31]。

圖 3 H2 EPS對(duì)的清除作用Fig. 3 Superoxide anion radical scavenging capacity of H2 EPS

由圖3可知，清除率隨著H2 EPS和VC質(zhì)量濃度的增大，呈現(xiàn)先急速升高后保持平穩(wěn)的變化趨勢(shì)，在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，H2 EPS和VC對(duì)的清除率達(dá)到最大，分別為（97.34f 2.31）%和（58.46f 1.72）%。葉廣彬等[23]研究EPS對(duì)清除能力發(fā)現(xiàn)，在質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時(shí)，清除率大于70%，高于本研究中的EPS清除效率。能夠與大量生物活性分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使得DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等發(fā)生氧化損傷。因此可以看出，H2 EPS對(duì)具有顯著的清除活性，可以作為添加劑減小對(duì)機(jī)體的損傷程度。

2.5.3 對(duì)?OH的清除作用

圖 4 H2 EPS對(duì)?OH的清除作用Fig. 4 Hydroxyl radical scavenging capacity of H2 EPS

如圖4所示，清除率隨質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先升高后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)， H2 EPS和VC對(duì)?OH的清除率分別為（42.56f 2.16）%和（94.34f 5.67）%。Ye Guangbin等[31]研究W. cibariaYB-1 EPS的抗氧化能力發(fā)現(xiàn)，EPS的抗氧化能力隨著質(zhì)量濃度的增加而不斷升高，在質(zhì)量濃度4 mg/mL時(shí)，?OH清除率為80%。此外，本研究結(jié)果與崔靜等[32]結(jié)果相一致，EPS6對(duì)?OH具有良好的清除作用。

2.5.4 對(duì)DPPH自由基的清除作用

圖 5 H2 EPS對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig. 5 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging capacity of H2 EPS

如圖5所示，隨著H2 EPS質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除率逐漸增大，但始終低于VC的清除率。當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，H2 EPS對(duì)DPPH自由基的清除率為（48.45f 2.47）%。DPPH自由基是一類較為穩(wěn)定的合成自由基，可以將其清除的化學(xué)物質(zhì)具有較強(qiáng)的自由基清除能力。Ye Guangbin等[31]研究W. cibariaYB-1 EPS的抗氧化能力，結(jié)果表明，該EPS隨著質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除能力逐漸升高，在5 mg/mL的時(shí)候，DPPH自由基清除率達(dá)到50%，與本研究中EPS對(duì)DPPH自由基清除率相似。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從自制水果發(fā)酵液中分離得到一株高產(chǎn)EPS的乳酸菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定該菌株為W. confusa，并命名為W. confusaH2。以該菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)EPS，并分離純化，得到高純度EPS，其產(chǎn)量為（40.21f 3.63）g/L。H2 EPS的溶解率和持水率分別為（98.78f 1.37）%和（426.03f 7.26）%。此外，H2 EPS具有良好的乳化性、抑菌性能和較高的抗氧化活性，且隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。因此，W. confusaH2發(fā)酵得到的EPS作為天然食品添加劑或抗氧化劑具有廣闊的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)前景。