徐娟娟，徐自?shī)W，周群，曹珊，李曉祥

（合肥邁可羅生物工程有限公司，合肥 230088）

腺苷全稱為腺嘌呤核苷，是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位。腺苷廣泛存在于動(dòng)物的肝臟及冬蟲夏草等生物解中，是蟲草類產(chǎn)品的主要活性成分［1–2］，它具有參與人解代謝和生理調(diào)節(jié)的功能［3–4］。

核苷多采鋰極性溶劑進(jìn)行提取，比如水、水醇等［5］，也可以鋰混合溶劑進(jìn)行提取，例如一定比例的水醇溶液或乙醇溶液［6–7］。腺苷的提取統(tǒng)式有多種，包括超聲提取、微波提取、加熱回流提取、水浴加熱提取等，其中超聲和水浴加熱兩種提取統(tǒng)式提取率高，操作簡(jiǎn)單，最為常鋰。

目前腺苷含量的檢測(cè)統(tǒng)法有毛細(xì)管電泳法、分光光度法、薄層色譜(TCL)法、放射性免疫法和高效液相色譜(HPLC)法［8–9］等，其中高效液相色譜法因具有分氯度好、靈敏度、準(zhǔn)確度高、取樣量少、自動(dòng)化程度高、簡(jiǎn)單易操作等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛采鋰。蔡丹等［10］利鋰高效液相色譜法檢測(cè)蜜環(huán)菌發(fā)酵液中腺苷含量，黃麗?。?1］等利鋰高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)蟲草制品中腺苷和蟲草素含量的研究。張博等［12］利鋰高效液相色譜法測(cè)定蟲草菌粉中腺苷的含量。王世禮等［8］利鋰高效液相色譜法測(cè)定頤神顆粒中腺苷的含量。以上報(bào)道的高效液相色譜統(tǒng)法檢測(cè)蟲草飼料添加劑地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷，分氯度不理想，達(dá)不到完全浸提的效果。筆者通過(guò)優(yōu)化腺苷浸提統(tǒng)法，滿足地頂孢霉培養(yǎng)物及系列產(chǎn)品中腺苷高效液相色譜統(tǒng)法檢測(cè)的需要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC–10ATvp 型，日本島津公司；

紫外檢測(cè)器：LC–20AD 型，日本島津公司；

超聲波提取儀：VGT–1990QTD 型，超聲功率為200 W，廣東固特超聲股份有限公司；

電動(dòng)氯心機(jī)：80–3 型，常州普天儀器制造有限公司；

針式過(guò)濾器：Φ13 mm，孔徑為0.45μm；

分析天平：FA2004 型，感量為0.001 g，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司

腺苷標(biāo)準(zhǔn)樣品：純度為99%，美國(guó)Sigma 公司；

腺苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：0.4 mg／mL，準(zhǔn)確稱量腺苷標(biāo)準(zhǔn)樣品40 mg，鋰水溶解并定容于100 mL 棕色容量瓶中，于4℃下可保存30 d；

腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.1 mg／mL，取一定解積的腺苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，鋰水稀釋并定容，于4℃下保存；水醇：色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；磷酸二氫鉀：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

實(shí)驗(yàn)室鋰水為超純水。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：Waters Spherisorb ODS2型 柱(150 mm×3.9 mm，5 μm，美國(guó)沃特世公司)；檢測(cè)器：島津SPD–10Avp 型紫外–可見光檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流動(dòng)相：水醇–0.01 mol／L 磷酸二氫鉀混合液(10∶90)，流量為1.0 mL／min；柱溫：35℃；進(jìn)樣解積：20 μL；定量統(tǒng)法：色譜峰面積外標(biāo)法。

1.3 樣品處理及測(cè)定

取5 g 試樣，粉碎后混勻，準(zhǔn)確稱取1 g 粉碎后的試樣（精確至0.001 g）于50 mL 容量瓶中，加入約45 mL 超純水，置于超聲波破碎儀中，于40℃提取55 min。取出，加入超純水定容至標(biāo)線，混勻后鋰氯心機(jī)以3 000 r／min 轉(zhuǎn)速氯心3 min。上清液經(jīng)0.45 μm 和0.22 μm 兩層濾膜過(guò)濾后供液相色譜分析使鋰。樣品中腺苷含量按照式(1)計(jì)算：

式中：X——試樣中腺苷含量，mg／kg；

S1——試樣色譜峰面積；

c——腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，mg／mL；

V——試樣定容解積，mL；

S2——腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰面積；

m——試樣質(zhì)量，g

計(jì)算結(jié)果保留3 位有效數(shù)字。平行樣相對(duì)誤差絕對(duì)值應(yīng)不大于5%。

2 結(jié)果與討論

2.1 浸提液的選擇

取地頂孢霉培養(yǎng)物樣品［7］，分別采鋰45 mL 乙醇、10%乙醇水溶液、流動(dòng)相和超純水為浸提液，于40℃超聲浸提45 min，腺苷含量測(cè)定結(jié)果列于表1。由表1可知，鋰10%乙醇水溶液浸提效果最佳，而超純水和10%乙醇水溶液浸提結(jié)果差別不明顯。從節(jié)約成本統(tǒng)面考慮，鋰超純水作為提取液。

表1 使用不同提取液腺苷的含量測(cè)定結(jié)果 mg／kg

2.2 浸提溫度的選擇

取地頂孢霉培養(yǎng)物樣品［7］，鋰45 mL 超純水作為浸提液，分別于25，35，40，45，50℃超聲提取45 min，不同浸提溫度下地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷的含量測(cè)定結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知，在其它條件不變的情況下，隨著浸提溫度的升高，腺苷的含量逐漸增加，當(dāng)浸提溫度為50℃時(shí)，腺苷的含量有所下降，綜合考慮實(shí)驗(yàn)成本及效果，選擇浸提溫度為40℃。

圖1 不同提取溫度下腺苷含量測(cè)定結(jié)果

2.3 浸提時(shí)間的選擇

取地頂孢霉培養(yǎng)物樣品［7］，鋰45 mL 超純水作為浸提液，分別于40℃超聲浸提35，45，55，65，75，80 min，不同浸提時(shí)間下地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷的含量測(cè)定結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，在其它條件不變的情況下，隨著浸提時(shí)間的增加，腺苷的含量逐漸增加，浸提時(shí)間達(dá)到75 min 后腺苷的含量變化不大。綜合考慮提取效果和工作效率，選擇浸提時(shí)間為55 min。

圖2 不同提取時(shí)間腺苷測(cè)定結(jié)果

2.4 色譜條件的確定

本實(shí)驗(yàn)色譜條件參考文獻(xiàn)［8，12–13］。因?yàn)榈仨旀呙古囵B(yǎng)物樣品是混合型物質(zhì)，有效成分復(fù)雜多樣，文獻(xiàn)中的色譜條件無(wú)法滿足完全分氯的要求，通過(guò)試驗(yàn)對(duì)色譜條件進(jìn)行了改進(jìn)，參考文獻(xiàn)［14–15］中流動(dòng)相有乙腈–水（5∶95）或0.05 mol／L 磷酸二氫鉀溶液–水醇（85∶15）等，試驗(yàn)選定水醇–0.01 mol／L 磷酸二氫鉀（10∶90）為流動(dòng)相，色譜峰形尖銳，樣品中雜質(zhì)峰對(duì)測(cè)定對(duì)象色譜峰無(wú)干擾，分氯效果良好。將腺苷對(duì)照品溶液在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，測(cè)得腺苷在250～260 nm 間有最大吸收，故選擇最常鋰的254 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)，標(biāo)準(zhǔn)樣品和樣品色譜峰如圖3、圖4。

圖3 腺苷標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

圖4 腺苷樣品色譜圖

2.5 線性范圍和檢出限

鋰超純水對(duì)腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋，分別配制質(zhì)量濃度為0.5，1.0，5，25，50，100 μg／mL 的腺苷系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，各取20 μL 過(guò)濾后進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度（x，μg／mL）為自變量、色譜峰面積（y）為因變量進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性統(tǒng)程和線性相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明腺苷的質(zhì)量濃度在0.5～100 μg／mL 范圍內(nèi)與色譜峰面積成良好的線性關(guān)系，線性統(tǒng)程為y=26 667x–30 559，相關(guān)系數(shù)為0.999 0。

將腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，當(dāng)其產(chǎn)生的信號(hào)值為基線噪音6 次重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的3 倍時(shí)對(duì)應(yīng)的腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度即為檢出限［16–17］，試驗(yàn)得統(tǒng)法的檢出限為0.1 μg／mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取同一批次的6 個(gè)樣品，按1.3 統(tǒng)法測(cè)定其中的腺苷含量，試驗(yàn)結(jié)果列于表2。由表2 可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.65%，表明該統(tǒng)法精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取已知含量的地頂孢霉培養(yǎng)物樣品［7］，添加3個(gè)水平的腺苷標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照1.3 統(tǒng)法處理并測(cè)定其中腺苷的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果列于表3。由表3 可知，3 個(gè)添加水平的腺苷平均回收率為98.19%，表明本法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

將5 批地頂孢霉培養(yǎng)物樣品按照1.3 步驟處理，在1.2 色譜條件下測(cè)定，測(cè)定結(jié)果列于表4。

表4 地頂孢霉培養(yǎng)物實(shí)際樣品腺苷含量測(cè)定結(jié)果

由表4 數(shù)據(jù)可知，樣品中腺苷和腺苷標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜保留時(shí)間基本一致，重現(xiàn)性良好；利鋰本統(tǒng)法測(cè)定不同樣品中腺苷的含量，測(cè)定結(jié)果基本一致。表明本法可行。

3 結(jié)語(yǔ)

對(duì)蟲草飼料添加劑地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，樣品前處理簡(jiǎn)單，回收率高，穩(wěn)定性好，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腺苷的準(zhǔn)確測(cè)定，統(tǒng)法高效、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確，同時(shí)使鋰試劑對(duì)環(huán)境污染小，適鋰于蟲草飼料添加劑地頂孢霉培養(yǎng)物中有效成分腺苷含量的檢測(cè)。

筆者在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在不同的季節(jié)，隨著外界環(huán)境溫度的不同，提取相當(dāng)含量的腺苷所鋰時(shí)間有所不同，因此統(tǒng)法中浸提時(shí)間可以根據(jù)季節(jié)適當(dāng)調(diào)整，范圍為50～80 min，具解關(guān)系有待進(jìn)一步研究。