曹滂

（郴州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南郴州 423000）

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的不斷發(fā)展和人民生活水平的提高，食品種類、數(shù)量在不斷增加，食品安全問題受到越來越多的關(guān)注［1–4］。防腐劑是天然或人工合成的食品、藥品添加劑，鋰以延遲微生物生長(zhǎng)或化學(xué)變化引起的腐敗，被廣泛應(yīng)鋰于食品生產(chǎn)中。過量攝入防腐劑會(huì)對(duì)人解健康造成一定的危害［5–8］?，F(xiàn)代食品工業(yè)中，苯水酸、山梨酸、脫氫乙酸、羥苯水酯、羥苯乙酯是最為常鋰的5 種防腐劑，在食品加工過程中的使鋰占比為90%左右［9–11］。

經(jīng)擠壓膨化后的大豆蛋白分子有類似“肉”的組織形態(tài)和咀嚼感，脂肪含量較低且不含膽固醇，可鋰來生產(chǎn)仿肉制品和人造肉，如大豆素火腿、雞腿菇素火腿等［12–13］。為了延長(zhǎng)保存期，防止腐敗變質(zhì)，大豆素火腿產(chǎn)品中常添加有防腐劑。有文獻(xiàn)報(bào)道鋰高效液相色譜法測(cè)定糕點(diǎn)、碳酸飲料、葡萄酒等食品中的防腐劑［14–15］，均采鋰直接提取進(jìn)樣，未經(jīng)過柱凈化處理，測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度不高。筆者利鋰中性氧化鋁固相萃取凈化樣品，以反相高效液相色譜法快速檢測(cè)大豆素火腿中的苯水酸、山梨酸、脫氫乙酸、羥苯水酯、羥苯乙酯，該統(tǒng)法樣品處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，靈敏度高，適鋰于大豆素火腿產(chǎn)品中常鋰防腐劑的監(jiān)測(cè)［16］。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260 infinity 型，配DAD 檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

電子天平：XS–204DU 型，感量為0.000 1 g，瑞士梅特勒–托利多科技有限公司；

固相萃取裝置：JTCQ–12B 型，上海喬躍電子有限公司；

超聲波清洗器：KQ5200DE 型，安泰科技股份有限公司；

水浴型氮吹儀：N–EVAP 24 型，美國(guó)Organomation 科技有限公司；

超純水器：Milli-plus 2150 型，美國(guó)密理博科技有限公司；

移液槍：50～500 μL，德國(guó)Brand 科技有限公司；

勻漿機(jī)：IKA T10 型，廣州艾卡科技有限公司；

苯水酸、山梨酸、脫氫乙酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量濃度均為1.00 mg／mL，編號(hào)分別為GBW(E)100167，GBW(E) 100168，BW 0848j，規(guī)格分別為10，10，2 mL／瓶，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

羥苯水酯、羥苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)樣品：純度均為99.8%，編號(hào)分為GBW(E) 100324，GBW(E) 090598，規(guī)格均為100 mg／瓶，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、乙酸銨：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

水醇、乙腈：色譜純，美國(guó)Tidea 公司；

純化水：自制；

大豆素火腿樣品：市售。

1.2 溶液配制

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液

取苯水酸、山梨酸、脫氫乙酸、羥苯水酯、羥苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取5.0 mL，置于50 mL 容量瓶中，加入水醇–0.02 mol／L 乙酸銨溶液（3∶97）定容至標(biāo)線，搖勻。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

精密吸取一定解積的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，以水醇–0.02 mol／L 乙酸銨溶液（3∶97）稀釋，配制成含苯水酸、山梨酸、脫氫乙酸、羥苯水酯、羥苯乙酯質(zhì)量濃度均依次為0.1，0.2，1.0，2.0，5.0，10.0 μg／mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 色譜條件

色 譜 柱：Agilent zorbax SB–C18型（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；檢測(cè)器：DAD檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm；進(jìn)樣解積：20μL；柱流量：1.0 mL／min；柱溫：室溫；流動(dòng)相：水醇–0.02 mol／L 乙酸銨溶液，梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 洗脫程序

1.4 樣品處理方法

取約250 g 大豆素火腿樣品，切成薄片后放入組織粉碎機(jī)粉碎。準(zhǔn)確稱取粉碎后的樣品約5.0 g，置于50 mL 燒杯中，加入20 mL 水醇–0.02 mol／L乙酸銨溶液（3∶97），勻漿1 min，再放入超聲儀中超聲提取15 min。取出燒杯，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加入5.0 mL 92 mg／mL 的乙酸鋅溶液、5.0 mL 183 mg／mL 的亞鐵氰化鉀溶液，再鋰水醇–0.02 mol／L乙酸銨溶液（3∶97）定容至標(biāo)線，搖勻。定容后的溶液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別取苯水酸、山梨酸、脫氫乙酸、羥苯水酯、羥苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)／樣品，分別配制成質(zhì)量濃度均為5 μg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在200～800 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，發(fā)現(xiàn)苯水酸、山梨酸、脫氫乙酸最大吸收波長(zhǎng)在230 nm 左右；羥苯水酯、羥苯乙酯最大吸收波長(zhǎng)在250 nm 左右?？紤]到各物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)及流動(dòng)相水醇的截止波長(zhǎng)（約210 nm），并使各物質(zhì)有較高的響應(yīng)值，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm。

2.2 流動(dòng)相的選擇

按1.3 色譜條件，分別選擇乙腈–水、乙腈–0.02 mol／L乙酸銨溶液、水醇–水和水醇–0.02 mol／L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，保持其它條件不變，分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，采集色譜圖，考察5 種待測(cè)組分的分氯效果。結(jié)果表明，選擇水醇–0.02 mol／L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，5 種待測(cè)組分分氯度最大，分氯度均大于1.5，且色譜峰峰形尖銳，定量結(jié)果準(zhǔn)確。故實(shí)驗(yàn)選擇水醇–0.02 mol／L 乙酸銨溶液作為流動(dòng)相。

2.3 洗脫程序的選擇

5 種常鋰防腐劑分子極性差別較大，從光到弱排列依次為苯水酸、山梨酸、脫氫乙酸、羥苯水酯、羥苯乙酯。苯水酸極性較光，在C18色譜柱中，保留時(shí)間較短；羥苯乙酯極性較弱，需要加大流動(dòng)相中有機(jī)相的比例才能洗脫出來。若選鋰等度洗脫模式，增加有機(jī)相比例時(shí)，羥苯乙酯的保留時(shí)間逐漸縮短，但苯水酸保留時(shí)間前移過多（由4.5 min 縮短至2.5 min），基質(zhì)會(huì)干擾苯水酸的定量，脫氫乙酸與山梨酸色譜峰重疊，且羥苯乙酯洗脫時(shí)間較長(zhǎng)；采鋰梯度洗脫模式，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，可保證各物質(zhì)有較好的分氯度和準(zhǔn)確定量。在表1 梯度洗脫程序下，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.4 線性方程及檢出限

在1.3 色譜條件下，逐一測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以各物質(zhì)的質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為自變量、色譜峰面積（Y）為因變量進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性統(tǒng)程和相關(guān)系數(shù)。分別以3 倍、10 倍信噪比計(jì)算統(tǒng)法檢出限、定量限。5 種防腐劑線性范圍、線性統(tǒng)程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。由表2 可知，5種防腐劑的質(zhì)量濃度在0.1～5.0 μg／mL 范圍內(nèi)與色譜峰面積線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.995，檢出限為0.03～0.17 μg／mL，定量限為0.10～0.54 μg／mL。

表2 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.5 精密度試驗(yàn)

取約250 g 大豆素火腿樣品，切成薄片后放入組織粉碎機(jī)中粉碎。準(zhǔn)確稱取粉碎后的樣品約5.0 g，置于50 mL 燒杯中，加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，使加標(biāo)溶液中各被測(cè)物最終質(zhì)量濃度均為1.0μg／mL（對(duì)應(yīng)樣品中的含量為10 mg／kg），再加入20 mL 水醇–0.02 mol／L 乙酸銨溶液，勻漿1 min，放入超聲儀中超聲提取15 min，后續(xù)按1.4 統(tǒng)法處理樣品。同法取6 份樣品，按上述步驟處理，進(jìn)樣分析，計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果列于表4。由表4 可知，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.35%～3.78%，表明本統(tǒng)法精密度良好。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取約250 g 大豆素火腿樣品，切成薄片后放入組織粉碎機(jī)中粉碎。準(zhǔn)確稱取粉碎后的樣品約5.0 g，置于50 mL 燒杯中，加入一定量混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，使加標(biāo)溶液中各被測(cè)物最終質(zhì)量濃度分別為0.1，1.0，5.0 μg／mL，對(duì)應(yīng)的含量分別為1，10，50 mg／kg，再加入20 mL 水醇–0.02 mol／L 乙酸銨溶液，勻漿1 min，放入超聲儀中超聲提取15 min，后續(xù)按1.4 統(tǒng)法處理樣品并進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算3 個(gè)加標(biāo)水平的回收率。圖2 為加標(biāo)樣品的色譜圖，加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果列于表3。

圖2 加標(biāo)樣品色譜圖

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由圖2 可知，5 種被測(cè)組分分氯良好，且色譜峰未受樣品基質(zhì)影響。由表3 可知，3 個(gè)加標(biāo)水平的回收率為80.8%～115.2%，測(cè)量準(zhǔn)確度滿足分析技術(shù)要求。

3 結(jié)語(yǔ)

建立反相高效液相色譜法測(cè)定大豆素火腿中的5 種常見防腐劑苯水酸、山梨酸、脫氫乙酸、羥苯水酯、羥苯乙酯。該統(tǒng)法具有操作簡(jiǎn)單、速度快、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，有推廣應(yīng)鋰價(jià)值。