張 瓊 鄭國沛 何利珍

舌鱗狀細(xì)胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)是最常見的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，惡性度高、侵襲性強，患者預(yù)后差，5年生存率僅50%左右[1]。由于舌癌早期癥狀不明顯，致使部分患者確診時已屬中晚期，因此單純的手術(shù)切除難以達到理想的預(yù)后效果，此時化療在整個治療過程中的獨特優(yōu)勢就顯現(xiàn)出來。順鉑作為舌癌常用的化療藥物，在治療中顯示了明顯的療效，但是隨著治療時間的延長，患者會對其出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，這也是治療失敗的主要原因。

我們在前期研究中通過平陽霉素(PYM)誘導(dǎo)產(chǎn)生了人TSCC多藥耐藥細(xì)胞株Tca8113/PYM，MTT實驗顯示其對包括順鉑在內(nèi)的多種抗腫瘤藥物表現(xiàn)出多藥耐藥性。與其親本細(xì)胞相比，Tca8113/PYM細(xì)胞中α-烯醇化酶(α-enolase，ENO1)蛋白表達水平上調(diào)[2]。ENO1是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，近年來研究發(fā)現(xiàn)ENO1與腫瘤化療耐藥密切相關(guān)。本文旨在探討ENO1在TSCC患者化療耐藥中的作用，及其與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人TSCC細(xì)胞株SCC-15、SCC-25購自美國ATCC，Tca8113細(xì)胞及其多藥耐藥細(xì)胞株Tca8113/PYM為本室保存，以含10%小牛血清RPMI-1640完全培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。

1.2 Westen blot

取對數(shù)生長期細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液(5×103個/ml)，接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔加180 μl，培養(yǎng)24 h后分別加入5 mg/l順鉑，每種細(xì)胞設(shè)4個復(fù)孔，培養(yǎng)2周后收集細(xì)胞。加入細(xì)胞裂解液抽提細(xì)胞總蛋白后，BCA法測定蛋白濃度。 將 60 μg總蛋白進10% SDS-PAGE分離，蛋白濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，與第一抗體室溫孵育2 h，洗膜3次后，將膜與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的第二抗體室溫孵育1 h，洗膜3次后用化學(xué)發(fā)光試劑ECL(enhanced chemiluminescence)發(fā)光、顯影和定影。

1.3 臨床資料

收集2011年1月至2012年12月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科87例TSCC石蠟標(biāo)本。所有患者均接受順鉑化療，并且臨床檢查未見遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。患者通過電話或門診隨訪，用藥后2年內(nèi)每3個月1次，2年后每半年1次?？偵鏁r間計算按從首次順鉑治療日開始至死亡或最后隨訪截止日，隨訪截止時間2017 年12 月31日。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，均取得患者知情同意。

1.4 免疫組化

所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，免疫組化采用EnVision兩步法，操作按試劑盒說明書進行。PBS 代替一抗為陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。以胞膜和胞質(zhì)呈現(xiàn)黃色、棕黃色顆粒為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)處理，ENO1表達與TSCC患者臨床病理特征的關(guān)系用χ2檢驗，對生存數(shù)據(jù)應(yīng)用Kaplan-Meier分析并繪制生存曲線，應(yīng)用Log-rank檢驗差異。

2 結(jié)果

2.1 ENO1在舌癌細(xì)胞系中的蛋白表達

為了探討ENO1在化療中的作用，我們檢測了一系列TSCC細(xì)胞中ENO1蛋白表達改變。順鉑處理后，各細(xì)胞系中ENO1蛋白表達水平均升高(圖1)。

2.2 ENO1表達與TSCC臨床病理特征的關(guān)系

87例TSCC患者標(biāo)本中ENO1高表達51例(58.62%)，ENO1低表達36例(41.38%)。ENO1高表達與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別及分化程度無相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

表1 ENO1表達與TSCC臨床病理特征的關(guān)系/例

2.3 ENO1表達與TSCC患者預(yù)后的關(guān)系

TSCC患者ENO1高表達者中位生存時間(46.00±4.08)個月，低表達者中位生存時間(70.00±10.05)個月，ENO1高表達者中位生存期明顯短于低表達者，2組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.447，P=0.006)，見圖2。

圖2 ENO1高表達與低表達者生存曲線

3 討論

ENO1是由2個含有433個氨基酸、分子質(zhì)量約47 kD的亞單位構(gòu)成的二聚體，是一種糖酵解酶限速酶，是影響細(xì)胞能量代謝的重要因素。近年來的研究發(fā)現(xiàn)ENO1的功能不僅僅限于催化糖酵解反應(yīng)，它可能是一個在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等多個過程中均發(fā)揮重要作用的癌基因[3-4]，在多種腫瘤中表達升高。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)ENO1與腫瘤化療耐藥關(guān)系密切。Shi等[5]通過比較蛋白質(zhì)組研究顯示，阿霉素耐藥性髓系白血病細(xì)胞中ENO1蛋白表達升高。Chen等[6]也發(fā)現(xiàn)氨甲蝶呤誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥性乳腺癌MCF-7/MTX細(xì)胞與藥物敏感性MCF-7細(xì)胞相比，ENO1蛋白表達水平上調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)[7]，與其親本細(xì)胞CNE-2相比，多西他賽耐藥性鼻咽癌細(xì)胞CNE-2R中ENO1蛋白水平顯著升高。shRNA抑制ENO1表達后，CNE-2R細(xì)胞對多西他賽的敏感性恢復(fù)。過表達ENO1能使CNE-2細(xì)胞產(chǎn)生獲得性多西他賽耐藥。同時，在耐藥性鼻咽癌患者的標(biāo)本中也發(fā)現(xiàn)ENO1蛋白及RNA水平上調(diào)。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)順鉑處理細(xì)胞后，SCC-15、SCC-25、Tca8113及Tca8113/PYM細(xì)胞中ENO1蛋白表達升高，與前述研究結(jié)果一致。

放化療等抗腫瘤治療通過誘發(fā)自由基殺滅腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)ENO1蛋白水平上調(diào)后，糖酵解增強，細(xì)胞還原能力增強，阻斷過氧化途徑，消除代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物，從而促進藥物耐受形成[8-9]。此外，增強的糖酵解影響細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境，葡萄糖濃度變得更低，同時乳酸、丙酮酸及ATP含量升高[10]。細(xì)胞內(nèi)低濃度葡萄糖能使葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白表達增加，激活PI3K/AKT/mTOR通路以抑制凋亡、有利于細(xì)胞生存[11]。乳酸升高能增強DNA修復(fù)，通過失活組蛋白脫乙酰基酶，促進宮頸癌細(xì)胞中順鉑耐藥[12]。丙酮酸通過上調(diào)P糖蛋白表達，增強化療藥物外排而促進化療耐藥[13]。ATP被認(rèn)為是維持多藥耐藥表型的一種重要因素，ATP水平升高能直接活化帶有ATP結(jié)合元件的轉(zhuǎn)運體，將細(xì)胞內(nèi)的毒性藥物排出[14]。Chen等[6]發(fā)現(xiàn)在氨甲喋呤耐藥性乳腺癌細(xì)胞MCF-7中ENO1 mRNA水平輕度下降，與Peng等[7]研究結(jié)果不同。還有研究[15]發(fā)現(xiàn)ENO1調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路，在淋巴細(xì)胞粘附介導(dǎo)的藥物耐藥中起到重要作用。

在TSCC患者中，ENO1高表達與較高的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)具有顯著相關(guān)性，表明ENO1在腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。ENO1蛋白高表達提示患者預(yù)后較差。我們的研究結(jié)果，提示升高的ENO1可成為舌癌新療法的靶標(biāo)，對于舌鱗狀細(xì)胞癌精準(zhǔn)治療具有重要意義。