董學(xué)花 劉莉園 全吉淑 尹學(xué)哲

【摘 要】目的：研究草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷（IGBR）抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的相關(guān)機(jī)制。方法：1）將SMMC-7721細(xì)胞分為3組，對照組、模型組、IGBR組，對照組給予DMEM培養(yǎng)液，模型組給予濃度為10 ng/mL的TGF-β1造模，IGBR組給予濃度為10 ng/mL的TGF-β1誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）模型，再給予濃度為500 mg/mL的IGBR造模。2）對三組模型進(jìn)行蘇木素染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化，MTT法檢測細(xì)胞黏附能力，Western blot檢測Vimentin、Snail蛋白表達(dá)，免疫熒光檢測E-cadherin在細(xì)胞中表達(dá)情況。結(jié)果：與對照組比較，模型組TGF-β1誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞數(shù)量增多（P<0.01），與模型組比較，IGBR組細(xì)胞數(shù)量減少（P<0.01）;與模型組比較，IGBR組SMMC-7721細(xì)胞黏附能力降低（P<0.01）;與對照組比較，模型組Vimentin、Snail蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.05），與模型組比較，IGBR組Vimentin、Snail蛋白表達(dá)降低（P<0.05）;與對照組比較，模型組E-cadherin熒光強(qiáng)度減弱，與模型組比較，IGBR組E-cadherin熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。結(jié)論：IGBR可以抑制SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其機(jī)制與Vimentin、Snail蛋白表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷;肝癌;上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

【中圖分類號(hào)】R285 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1002-8714（2020）01-0123-01

肝癌以原發(fā)性肝癌多見，肝癌發(fā)病率居第六位，死亡率為第三位[1]。目前肝癌的轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，其治愈率低，效果較差，肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移與上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[2]。EMT是上皮細(xì)胞喪失上皮特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的生物過程，包括細(xì)胞形態(tài)和標(biāo)記蛋白的表達(dá)[3]。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

IGBR由延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室全吉淑教授惠贈(zèng);IGBR主要由從草蓯蓉中提取，人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院研究院提供;胎牛血清美國Gibco公司;兔抗人β-actin抗體、兔抗人E-cadherin抗體和鼠抗人Vimentin、Snail抗體購于Cell Signaling Technology公司;兔二抗北京中杉金橋公司;無菌超凈臺(tái)BIOAIR公司;cytation5多功能成像;儀全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）;凝膠顯像儀美國Protein Simple公司;CO2培養(yǎng)箱Thermo公司;IX70-1120倒置顯微鏡OLYMPUS公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)? 將SMMC-7721細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)液中加入10 %胎牛血清、100 U nit/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素，，每2～3 d傳代一次，取對數(shù)生長期（7 d）細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2造模方法 1）隨機(jī)分為3組，對照組、模型組、IGBR 組。對照組給予DMEM進(jìn)行造模，模型組給予濃度為10 ng/mL的TGF-β1進(jìn)行造模;IGBR 組給予濃度為10 ng/mL 的TGF-β1誘導(dǎo)形成EMT模型，模型成功后再給予濃度為500 mg/mL的 IGBR對其進(jìn)行造模。2）評估造模成功的方法：顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。IGBR 組細(xì)胞給予濃度為10 ng/mL的TGF-β1誘導(dǎo)48 h后即形成EMT模型[7]。采用Westem blot檢測EMT相關(guān)蛋白。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用%表示，采用X2分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1觀察SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)變化

顯微鏡觀察對照組SMMC-7721細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞呈圓形，多邊形;模型組SMMC-7721細(xì)胞由圓型逐漸變?yōu)殚L梭形，并集聚成團(tuán)，發(fā)生纖維樣改變;IGBR組SMMC-7721細(xì)胞數(shù)量減少及發(fā)生纖維樣改變的細(xì)胞數(shù)量減少;IGBR可以抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞EMT發(fā)生

2.3檢測SMMC-7721細(xì)胞黏附能力

SMMC-7721細(xì)胞黏附率/（%）=[（試驗(yàn)組OD值/對照組OD值）-1]×100%。模型組為143%，IGBR組為87%。與模型組比較，IGBR組的粘附率明顯降低（P<0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

肝細(xì)胞具有高度的再生能力，對人體的穩(wěn)態(tài)和組織修密切相關(guān)。有研究證實(shí)在腫瘤惡性病變時(shí)，TGF-β1是其啟動(dòng)子，TGF-β1可以誘導(dǎo)肝腫瘤細(xì)胞EMT，腫瘤細(xì)胞獲得間充質(zhì)表型，細(xì)胞的黏附能力增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)10ng/mL的TGF-β1可誘導(dǎo)肝腫瘤SMMC-7721細(xì)胞EMT。TGF-β1誘導(dǎo)后使細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生纖維樣改變，細(xì)胞黏附力增強(qiáng)。IGBR可以減少肝癌SMMC-7721細(xì)胞數(shù)量，降低細(xì)胞黏附能力，EMT標(biāo)志蛋白Vimentin、Snail蛋白表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，因此，IGBR可以抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞EMT。

參考文獻(xiàn)

[1] Dutta R，Mahato R I.Recent advances in hepatocellular carcinoma therapy[J].Pharmacol Ther，2017，173：106-117

[2] Giannelli G，Koudelkova P，Dituri F，et al.Role of epithelial to mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma[J].J Hepatol，2016，65（4）：798-808

[3] 張玉龍，張悅.草蓯蓉生物學(xué)特性及人工輔助寄生技術(shù)研究[J].國土與自然資源研究，2015（03）：88-90