羅 帆，熊珊珊

(東南大學(xué)機械工程學(xué)院，江蘇 南京 211189)

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對DNA結(jié)構(gòu)及其攜帶的遺傳信息的深入研究，促使DNA測序技術(shù)不斷地變化，成為生命科學(xué)的重要研究領(lǐng)域，極大地推動了生物工程、醫(yī)療技術(shù)以及其他學(xué)科的發(fā)展。第一代基因測序方法是以Sanger的雙脫氧鏈終止法[1]為核心的化學(xué)降解法，是人類基因組技術(shù)的核心測序方法，其測序精度高達99.999%，但是高成本和低通量的缺點使其無法實現(xiàn)大規(guī)模的商業(yè)應(yīng)用。為了降低測序成本以及提高測序基因的通量，人類進入了第二代基因測序時代。第二代基因測序方法以Roche公司454技術(shù)、illumina公司的Solexa和Hiseq技術(shù)以及ABI公司的Solid技術(shù)為代表，其主要特點是高通量和讀取速度快，一次可以對幾十萬條乃至幾百萬條DNA分子的堿基進行測序，它促進了人類對物種轉(zhuǎn)錄組測序以及基因組深度測序方法的發(fā)展，但是其試劑價格昂貴，使得第二代基因測序的成本高達幾十萬美元。近年來，基于單分子納米孔技術(shù)的第三代測序方法應(yīng)運而生，其主要是通過分辨4種堿基結(jié)構(gòu)的細微差異而導(dǎo)致不同堿基在通過納米孔時產(chǎn)生不同的離子阻塞電流來進行測序，測序過程不需要試劑，且測序速度比一、二代測序方法快，有望進一步降低測序成本，從而改進人類由基因缺陷引起疾病的治療方法[2-5]。為了證明基于單分子納米孔的第三代測序技術(shù)的精準性[6-7]，本文利用字符串匹配算法模擬單分子探針PNA(肽核酸)與λDNA通過雙層納米孔芯片匹配實驗來計算單分子探針讀取λDNA的精確度。

1 匹配算法

匹配算法的基本原理：把λDNA的堿基信息看成一個長字符串，PNA探針看成一個短字符串，把PNA探針與λDNA的匹配變成短字符串與長字符串的匹配。

圖1所示為PNA/λDNA模擬實驗的流程圖，圖中V為PNA探針字符串，B為λDNA的字符串，C為探針讀取λDNA堿基位置數(shù)組，K為探針首個堿基讀取的λDNA堿基有效位置數(shù)組，Q為所有PNA探針讀取有效位置數(shù)組，P為各類探針匹配個數(shù)數(shù)組，lb為λDNA的長度(單位：b)，lc為探針讀取的位置長度(單位：b)，lq為探針讀取的有效位置長度(單位：b)，per為探針庫所有探針讀取λDNA的精確度。

在進行字符串匹配時，首先要進行的是探針的自動輸入。由于探針庫S的大小與探針組成堿基個數(shù)n成冪次方(S=4n)關(guān)系，故當n值較大時，探針庫的容量就會很大，自動輸入探針就十分必要。在MATLAB中，使用函數(shù)comb，只要輸入組成PNA探針的堿基個數(shù)及其堿基種類，就能直接生成一個包含探針所有類型的字符數(shù)組，只需要對字符數(shù)組中的單個字符串進行調(diào)用，就可實現(xiàn)PNA探針的自動輸入，如圖1中Ⅰ所示。其次在探針輸入之后，進行短字符串PNA探針與長字符串λDNA的匹配。使用字符串處理函數(shù)strncmp比較PNA探針堿基信息與λ DNA上的堿基片段是否相等,如圖1中Ⅱ所示。其匹配過程見表1，表中序號為λDNA中堿基的排列順序， A，C，G，T分別代表腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶。

圖1 PNA/λDNA模擬實驗的流程圖

表1 字符串匹配過程

如果PNA探針堿基信息與λDNA上讀取的堿基信息相同，則輸入當前PNA探針首個堿基在λDNA上的位置，然后PNA探針往后移動其堿基個數(shù)大小的位置再繼續(xù)與λDNA上的堿基片段進行匹配；如果不同，PNA探針往后移動一個位置繼續(xù)與λDNA上的堿基片段進行匹配，直至PNA探針最后一個堿基對應(yīng)λDNA的最末端位置或超出最末端時，該種探針匹配過程結(jié)束，接著進行下一種探針與λDNA的匹配。以此類推，直至探針庫中所有的探針與λDNA匹配完，PNA/λDNA模擬實驗結(jié)束。

由于芯片具有一定的厚度，當前一個PNA探針未完全通過納米孔通道而后一個PNA探針進入納米孔通道時，堿基過孔電流信號就會互相干擾，從而無法準確讀取出λDNA上相應(yīng)的堿基片段信息，因此PNA探針之間必須有一定的間隔，滿足間距要求的PNA探針的位置為有效位置。在有效位置篩選階段，可以對PNA探針輸出首個堿基位置與相鄰的PNA探針輸出的位置進行比較，即通過芯片的厚度算出對應(yīng)的堿基數(shù)目間距d,當PNA探針與其相鄰PNA探針的間距大于d時，PNA探針讀取的位置才為有效位置，如圖1中Ⅲ所示。有效位置篩選的具體流程見表2，表中序號為λDNA中堿基的排列順序。

表2 有效位置篩選過程

在表2中,取有效間距d=15 b(b,堿基)，PNA探針的堿基序列為GGG，由于與λDNA匹配的PNA探針序號②和③的間距為12 b，兩者通過芯片時產(chǎn)生的信號會重疊而無法區(qū)分，故只有序號為①、④和⑤的PNA探針所讀取的λDNA的位置為有效位置。

得到單種PNA探針首個堿基讀取λDNA的位置之后，生成PNA探針匹配λDNA的個數(shù)數(shù)組P，如圖1中Ⅳ所示。

將所有種類的PNA探針讀取的有效位置存放在一個向量中，然后進行數(shù)據(jù)處理，剔除掉重復(fù)的數(shù)據(jù)，向量中剩下的數(shù)據(jù)即為PNA探針所有堿基讀取的λDNA堿基信息，再與λDNA的堿基總數(shù)進行對比，結(jié)果即為PNA探針讀取λDNA的精確度，如圖1中V所示。

2 實驗結(jié)果及分析

分別對3merPNA探針和5merPNA探針與λDNA進行匹配實驗，測試其匹配λDNA的精確度。

由于PNA探針由腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)4種堿基組成，為了區(qū)別不同探針，采用四進制對其進行編碼，順序依次為A，C，G，T。例如圖2中橫坐標2代表PNA探針的堿基序列AAC，圖3中橫坐標10代表PNA探針的堿基序列AAAGC。圖2和圖3分別為間隔d為12 b時，3merPNA探針和5merPNA探針與λDNA匹配數(shù)量直方圖。

圖2 3merPNA與λDNA匹配數(shù)量直方圖

圖3 5merPNA與λDNA匹配數(shù)量直方

從圖2和圖3可以得知，當PNA探針堿基個數(shù)相同時，不同種類的PNA探針匹配的λDNA的個數(shù)相差很多，PNA探針堿基個數(shù)越多，能夠與λDNA匹配的數(shù)目就越少。為了了解PNA探針匹配λDNA的精確度per與PNA探針間距d之間的關(guān)系，取d=0～50進行計算，結(jié)果如圖4所示。

圖4 精確度per與間距d關(guān)系圖

由圖4可知，相鄰2個3merPNA探針的間距d在0～50時，精確度per隨著間距d的增大而減少，從98.75%下降到42.13%；而5merPNA探針的精確度受d的變化影響不大，僅從99.99%下降到了99.50%。

3 結(jié)束語

本文通過字符串匹配算法來模擬PNA探針與λDNA匹配過程，模擬實驗結(jié)果證明了基于單分子納米孔的第三代測序技術(shù)能精確地讀取DNA的堿基信息，其精確度可高達99.99%，為第三代基因測序技術(shù)提供了一定的理論依據(jù)。