譚同才 余艷梅 程瑞動(dòng)

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎是臨床上常見的疾病，其主要臨床特點(diǎn)為關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退變，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。鹿瓜多肽具有消炎鎮(zhèn)痛、促進(jìn)成骨、調(diào)節(jié)骨代謝和促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)等作用。研究表明，鹿瓜多肽穴位注射治療老年性膝關(guān)節(jié)炎有良好療效[2]，已被廣泛應(yīng)用于臨床。隨著康復(fù)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，運(yùn)動(dòng)療法在延緩老年膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展中的作用越來(lái)越明確，但有關(guān)鹿瓜多肽聯(lián)合運(yùn)動(dòng)療法治療膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎研究報(bào)道尤其基礎(chǔ)研究較少[3]。本研究觀察鹿瓜多肽穴位注射結(jié)合運(yùn)動(dòng)療法對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原、血清MMP-3 水平的影響，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4 周齡雄性Sprague Dawley 大鼠48只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條件合格證：SYXK（浙）2013-0184，實(shí)驗(yàn)者動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證號(hào)：X1803347。按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼養(yǎng)，動(dòng)物房室溫18～22℃，相對(duì)濕度40%～60%，每天明暗時(shí)間各為12h，自由攝食飲水。所有大鼠實(shí)驗(yàn)之前均未進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)及其他刺激。

1.2 主要儀器與試劑 動(dòng)物跑步機(jī)（型號(hào)FT-200，成都泰盟科技有限公司，中國(guó)）；顯微鏡（Olympus 公司，日本）；弗氏完全佐劑、蕃紅-O 染料（Sigma 公司，美國(guó)）；基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）ELISA 試劑盒（批號(hào)ab53015，Santa Cruz Biotechnology 公司，美國(guó)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組 48 只SD 大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、穴位注射組、注射結(jié)合跑臺(tái)組，每組12 只，四組大鼠處理之前均進(jìn)行3 天跑臺(tái)適應(yīng)訓(xùn)練（采用段氏PT2000 型鼠類跑臺(tái)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)，坡度0°，速度10m/min，時(shí)間10min，連續(xù)3 天），以保證實(shí)驗(yàn)前大鼠關(guān)節(jié)基本狀況無(wú)差異。正常對(duì)照組為健康大鼠，不做任何處理；模型組大鼠建立膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，造模成功后不做任何干預(yù)；穴位注射組參照模型組建模后給予鹿瓜多肽注射液穴位注射；注射結(jié)合跑臺(tái)組參照模型組建模后按照穴位注射組方法穴位注射基礎(chǔ)上，14 天后進(jìn)行中等強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練，持續(xù)6 周。

2.2 大鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型建立[4]通過(guò)關(guān)節(jié)腔注射的方式建立膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠，具體操作如下：采用10%水合氯醛0.3mg/kg，腹腔注射麻醉大鼠。成功麻醉后，在無(wú)菌條件下，由髕腱外側(cè)向大鼠右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1mL 弗氏完全佐劑，根據(jù)超疲勞易提前發(fā)生膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床發(fā)病特點(diǎn)，每天強(qiáng)制大鼠動(dòng)物活動(dòng)30～60min，7 天后如出現(xiàn)以下與臨床急性膝關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)一致的癥狀即可確定造模成功：（1）膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅、腫、熱、痛，同時(shí)軟組織腫脹或積液；（2）膝關(guān)節(jié)及其周圍僵硬、活動(dòng)受限；（3）膝關(guān)節(jié)病理切片鏡檢出現(xiàn)關(guān)節(jié)腔大量滲出液，軟表面粗糙，滑膜增生、粘連、肥厚等膝關(guān)節(jié)炎臨床病理學(xué)改變；（4）實(shí)驗(yàn)室膝關(guān)節(jié)積液檢查出現(xiàn)白介素1β（1L-1β）升高、透明質(zhì)酸（HA）含量降低。7 天后，三組大鼠造模均成功，無(wú)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染或死亡發(fā)生。所有操作均嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與保護(hù)條例規(guī)定。

2.3 穴位注射方法 首先將大鼠固定在固定器上，取穴梁丘、血海、委中以及足三里，使用細(xì)針頭注射器向各穴位注射鹿瓜多肽注射液，1 天1 次，0.1mL/天，連續(xù)14 天。具體取穴方式[5]如下：“委中”穴（膝關(guān)節(jié)背面正中），深度4mm；“足三里”穴（脛骨前結(jié)節(jié)旁開5mm），深度7mm；“梁丘”穴（髕骨外上緣3mm），深度5mm；“血?！毖ǎx骨內(nèi)上緣3mm），深度5mm。

2.4 跑臺(tái)訓(xùn)練 中等強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練方案[6]：上午8∶00～12∶00 進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，根據(jù)據(jù)Bedford 的中等運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度方案，跑臺(tái)坡度為0°，初始速度為18m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間30min，每天運(yùn)動(dòng)1 次，每周運(yùn)動(dòng)5 天，共6周。運(yùn)動(dòng)中可選用制造聲音、小木棒強(qiáng)迫驅(qū)動(dòng)等方式刺激大鼠使其持續(xù)運(yùn)動(dòng)，但運(yùn)動(dòng)過(guò)程中不用電刺激。

2.5 觀察指標(biāo)

2.5.1 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)觀察 關(guān)節(jié)軟骨取材：以缺損為中心獲取股骨遠(yuǎn)端位置，將其浸潤(rùn)在體積含量為4%的特定溶液中固定24h，隨后浸潤(rùn)在10%EDTA 脫鈣環(huán)境中，保持4 周時(shí)間，接著完成包埋切片，蕃紅O-固綠染色程序，進(jìn)行化學(xué)檢測(cè)。觀察方法：番紅O-固綠染色分析相應(yīng)軟骨的細(xì)胞狀態(tài)，序列特征，同時(shí)查看其基質(zhì)含量、潮線的構(gòu)成等。借助專業(yè)的光鏡設(shè)備進(jìn)行觀察，O’Driscoll 組織學(xué)評(píng)分對(duì)軟骨評(píng)分。

2.5.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)量 軟骨標(biāo)本切片后，進(jìn)行染色，水洗、封固，鏡下觀察等流程，最后拍照。采用Image-Proplus 6.0 圖像分析軟件，測(cè)定軟骨組織切片單位面積內(nèi)Ⅱ型膠原纖維免疫組織化學(xué)染色吸光度值。

2.5.3 ELISA 法測(cè)定實(shí)驗(yàn)前后大鼠血清MMP-3 水平 實(shí)驗(yàn)前大鼠完成麻醉處理后，在實(shí)驗(yàn)大鼠特定位置獲取血液1.2mL，常溫環(huán)境下實(shí)施凝固，隨后在低溫環(huán)境中離心處理（2000r/min）15min，獲得血清400μL，-80℃存儲(chǔ)，血樣收集完成后妥善處理傷口。四組大鼠麻醉完成后解剖胸腔，隨后在心臟位置抽血1.2mL，慢慢注入相應(yīng)的采血管中，運(yùn)用以上相同的方法測(cè)定MMP-3 含量。測(cè)定方法：借助專業(yè)的儀器在450nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度數(shù)值。將標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量含量作為水平坐標(biāo)，將A 值作為縱坐標(biāo)，按照樣品A值在對(duì)應(yīng)曲線中的狀態(tài)，計(jì)算實(shí)驗(yàn)前后MMP-3 含量。并計(jì)算實(shí)驗(yàn)前后相應(yīng)差值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。大體觀察評(píng)分（Mankin’s 評(píng)分）采用Kruskal-Wallis H 秩和檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊性，進(jìn)一步采用Bonferroni 法進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，采用Kruska-Wallis H 秩和檢驗(yàn)；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠干預(yù)前后軟骨切片O’Driscoll 評(píng)分比較 干預(yù)前模型組、穴位注射組和注射結(jié)合跑臺(tái)組三組大鼠評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），三組評(píng)分均低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)6 周后穴位注射組和注射結(jié)合跑臺(tái)組評(píng)分均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；注射結(jié)合跑臺(tái)組評(píng)分高于穴位注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 四組大鼠干預(yù)前后軟骨O'Driscoll 組織學(xué)評(píng)分比較（分，）

表1 四組大鼠干預(yù)前后軟骨O'Driscoll 組織學(xué)評(píng)分比較（分，）

注：正常對(duì)照組為健康大鼠，不做任何處理；模型組為膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠；穴位注射組為膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠穴位注射鹿瓜多肽注射液；注射結(jié)合跑臺(tái)組為膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠穴位注射鹿瓜多肽注射液+跑臺(tái)訓(xùn)練；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與穴位注射組比較，cP＜0.05

3.2 各組大鼠干預(yù)前后膝關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原含量比較 干預(yù)前模型組、穴位注射組和注射結(jié)合跑臺(tái)組三組間大鼠軟骨Ⅱ型膠原含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但均低于正常對(duì)照組（P＜0.05）；干預(yù)后穴位注射組和注射結(jié)合跑臺(tái)組大鼠軟骨Ⅱ型膠原含量均高于模型組（P＜0.05）；干預(yù)后注射結(jié)合跑臺(tái)組大鼠軟骨Ⅱ型膠原含量高于穴位注射組（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原吸光度比較（）

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原吸光度比較（）

注：正常對(duì)照組為健康大鼠，不做任何處理；模型組為膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠；穴位注射組為膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠穴位注射鹿瓜多肽注射液；注射結(jié)合跑臺(tái)組為膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠穴位注射鹿瓜多肽注射液+跑臺(tái)訓(xùn)練；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與穴位注射組比較，cP＜0.05

3.3 各組大鼠干預(yù)前后血清MMP-3 含量比較 干預(yù)前模型組、穴位注射組和注射結(jié)合跑臺(tái)組三組大鼠血清MMP-3 水平無(wú)明顯差異（P＞0.05），但均高于正常對(duì)照組（P 均＜0.05）；干預(yù)后穴位注射組和注射結(jié)合跑臺(tái)組血清MMP-3 水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）；干預(yù)后注射結(jié)合跑臺(tái)組血清MMP-3 低于穴位注射組（P＜0.05），見表3。

4 討論

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎主要病理特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨不斷丟失，關(guān)節(jié)內(nèi)部最為重要的膠原成分屬于Ⅱ型膠原，其占據(jù)的比例超過(guò)了整體膠原的90%[7]。造成關(guān)節(jié)軟骨失去生物力學(xué)特征的主要因素即為Ⅱ型膠原和蛋白多糖的改變，包括數(shù)量的變化和質(zhì)量的變化[8-9]。研究表明，MMP-3 是金屬蛋白酶組織中的關(guān)鍵組成，在基質(zhì)降解過(guò)程中扮演著重要的角色，對(duì)于多糖具備充分的裂解活性[10]，在軟骨破壞、特別是骨關(guān)節(jié)炎的病理發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用[11]。

表3 各組大鼠干預(yù)前后血清基質(zhì)金屬蛋白酶-3 含量比較（μg/L，）

表3 各組大鼠干預(yù)前后血清基質(zhì)金屬蛋白酶-3 含量比較（μg/L，）

注：正常對(duì)照組為健康大鼠，不做任何處理；模型組為膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠；穴位注射組為膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠穴位注射鹿瓜多肽注射液；注射結(jié)合跑臺(tái)組為膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠穴位注射鹿瓜多肽注射液+跑臺(tái)訓(xùn)練；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與穴位注射組比較，cP＜0.05

鹿瓜多肽注射液是動(dòng)植物中提取的多肽類活性成分，它能夠降低血黏度和紅細(xì)胞聚集程度、抑制前列腺素的釋放、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，抑制新合成的基質(zhì)降解；也能對(duì)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞有促進(jìn)分化和降低分化的雙重調(diào)節(jié)作用，阻止骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，鹿瓜多肽可以抑制炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和控制炎性介質(zhì)的釋放，達(dá)到消炎止痛的作用[12]。研究顯示，適量運(yùn)動(dòng)是維持正常關(guān)節(jié)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理功能的必要條件，過(guò)度運(yùn)動(dòng)或制動(dòng)均可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨有極大好處[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單一穴位注射組修復(fù)的軟骨組織從外部觀察表現(xiàn)為乳白色，透明度不夠，血清基質(zhì)的量在染色圖片中偏低，細(xì)胞形態(tài)不充分不平衡，排列雜亂，未觀察到潮線形成。雖然單一穴位注射治療的大鼠和穴位注射聯(lián)合運(yùn)動(dòng)治療的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨MMP-3 表達(dá)水平都降低，但是單一穴位治療組MMP-3 表達(dá)明顯高于穴位注射聯(lián)合運(yùn)動(dòng)治療組（P＜0.05），Ⅱ型膠原纖維含量低于穴位注射聯(lián)合運(yùn)動(dòng)治療組（P＜0.05）。Ⅱ型膠原纖維含量與關(guān)節(jié)軟骨的負(fù)重能力相關(guān)，說(shuō)明單一穴位治療組關(guān)節(jié)軟骨負(fù)重能力低于穴位注射聯(lián)合運(yùn)動(dòng)治療組[15]。雖然注射結(jié)合跑臺(tái)組大鼠的MMP-3 依然高于正常水平，修復(fù)的相應(yīng)軟骨組織跟健康軟骨組織依然存在差別，但明顯比單一穴位注射組更接近正常軟骨組織。

綜上所述，鹿瓜多肽注射液穴位注射結(jié)合中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可以降低大鼠血清MMP-3 含量，提高大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原纖維含量，這可能為膝關(guān)節(jié)炎治療提供一種臨床思路。但本實(shí)驗(yàn)有較多不足，比如中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度如何確定、穴位注射的穴位和劑量如何確定，遠(yuǎn)期大鼠負(fù)重能力的變化情況，穴位注射聯(lián)合運(yùn)動(dòng)降低MMP-3 的可能途徑等，這需要后期進(jìn)一步的研究。