劉振華，沈 力，吳士良△

(1蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院病理教研室， 江蘇 蘇州 215009； 2蘇州大學醫(yī)學部生物化學與分子生物學教研室， 江蘇 蘇州 215123)

胃癌是常見的消化道系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率率較高。人β1,3-N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶8(β-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 8，β3Gn-T8)是利用TBLASTN信息途徑，以信息探針β3GalT1在NCBI的EST數(shù)據(jù)庫進行同源篩選，從人肺cDNA文庫中克隆到的一種新的糖基轉(zhuǎn)移酶基因[1],該基因在結(jié)腸癌和肝癌高表達而且能夠促進結(jié)腸癌和肝癌侵襲轉(zhuǎn)移[2-3]，但關(guān)于該基因?qū)ξ赴┥飳W行為影響的研究較少。本研究探討β3Gn-T8對胃癌AGS細胞增殖的影響，為尋找胃癌的生物治療靶標提供線索。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃腺癌細胞株AGS由中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供。β3Gn-T8表達載體pEGFP-C1-β3Gn-T8由本實驗室構(gòu)建并保存。抗β3Gn-T8多克隆抗體由本實驗室制備。引物設計采用Genetyx軟件，并經(jīng)GenBank BLAST同源檢索后由上海英駿公司合成。β3Gn-T8的正向引物序列為5′-CCCTGACTTCGCCTCCTAC-3′，反向引物序列為5′-GGTCTTTGAGCGTC-TGGTTGA-3′;內(nèi)參照β-actin的正向引物序列為5′-CCTCTATGCCAACCACAGTGC-3′，反向引物序列為5′-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3′。10只SPF雌性 BALB/c裸小鼠[許可證號為SCXK(蘇)2007-0005)]購自蘇州大學實驗動物中心。annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自Invirogen；MTT和DMSO購自Sigma。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞株AGS培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清的Ham’s F12培養(yǎng)基中，置37 ℃、 5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d傳代1次。細胞貼壁生長，至70%～80%融合時，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA液消化傳代。

2.2pEGFP-C1和 pEGFP-C1-β3Gn-T8轉(zhuǎn)染AGS細胞 在轉(zhuǎn)染實驗前天將細胞接種于6孔培養(yǎng)皿(35 mm)，轉(zhuǎn)染當天，更換1 mL新鮮的無血清培養(yǎng)基，逐滴加入100 μL脂質(zhì)體/DNA混合物于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，邊加邊輕搖培養(yǎng)板。37 ℃孵育6 h，6 h后更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入2 mL含10%小牛血清的新鮮生長培養(yǎng)基。

2.3RT-PCR檢測β3Gn-T8的mRNA表達 轉(zhuǎn)染β3Gn-T8 表達載體后，分別在24 h、48 h和72 h收集細胞?？俁NA提取采用TRIzol一步法。RT操作如下：加入RNA模板4 μL、隨機引物2 μL、0.1%DEPC水9 μL，在70 ℃反應5 min后，迅速降至4 ℃，再加入5×MMLV緩沖液8 μL、25 mmol/L dNTP 1 μL、RNAsin 0.5 μL、MMLV 1 μL、0.1% DEPC水14.5 μL，經(jīng)過37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min反應后，迅速降至4 ℃。以所獲cDNA為模板，進行PCR擴增，體系如下：10×buffer 2.5 μL、MgCl21.5 μL、 dNTP 1 μL、GAPDH上下游引物各 1 μL、RT生成的cDNA 1 μL、Taq酶0.5 μL、加ddH2O補至反應體積25 μL。94 ℃ 5 min預變性；94 ℃變性30 s、55 ℃退火45 s 、72 ℃延伸75 s，循環(huán)25次，72 ℃后延伸7 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物10 μL和上樣緩沖液2 μL混合上樣，與DL2000 DNA marker一起在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳分離后，溴乙啶染色10 min，圖像分析儀(UVP)拍照并分析結(jié)果。圖像分析使用BandScan 4.0軟件，分析目的條帶總灰度，并使用內(nèi)參照校準。

2.4Western blot法檢測蛋白的表達 蛋白樣品制備及定量后， SDS-PAGE分離，時間3 h～4 h，起始電壓80 V，樣品進入分離膠后轉(zhuǎn)為130 V，電泳至溴酚蘭剛跑出即終止。剝膠進行轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)好的PVDF膜有蛋白的一面標記，1×麗春紅染液染色5 min～10 min，封閉液室溫下封閉1 h，將 I 抗用含0.05% Tween-20 的TBS稀釋至適當濃度，室溫下孵育1 h～2 h。同上法準備 II 抗稀釋液，室溫下孵育1 h～2 h后用TBST洗膜6次，每次5 min?；瘜W發(fā)光、顯影、定影，將膠片進行透射掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。使用BandScan 4.0分析條帶總灰度，并使用內(nèi)參照校準。

2.5MTT法測定細胞活力 將細胞分為3個實驗組:未處理對照(control)組、pEGFP-C1組和pEGFP-C1-β3Gn-T8組。將每組細胞接種于96孔板，消化細胞并調(diào)整細胞數(shù)，使每孔細胞數(shù)為4 000個，每組設4個復孔。分別于細胞處理24 h、48 h、72 h和96 h棄去上清，加入培養(yǎng)基180 μL，每孔再加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸出培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測儀上于570 nm 波長處讀取標本的吸光度(A)值，各組的吸光度與對照組的吸光度比值為細胞活力。

2.6臺盼藍染色活細胞計數(shù) 將處于對數(shù)生長期的未轉(zhuǎn)染組、pEGFP-C1組和 pEGFP-C1-β3Gn-T8組AGS細胞以每孔1×105個接種于 6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱過夜，24 h后，用胰酶消化細胞，采用臺盼藍染色，進行活細胞計數(shù)。

2.7流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將各組細胞接種于96孔板，消化細胞并調(diào)整細胞數(shù)，使每孔細胞數(shù)為4 000個，每組設4個復孔；細胞處理48 h后，調(diào)整待測細胞的濃度為5×108～1×109個/L；取1 mL細胞，1 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清；加入1 mL冷PBS，輕輕振蕩使細胞懸浮，1 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清；將細胞重懸于200 μL binding buffer；加入10 μL annexin V-FITC和10 μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應15 min；加入300 μL binding buffer，立即上機檢測。

2.8裸鼠飼養(yǎng)及體內(nèi)成瘤實驗檢測 4周～5周齡，體重20～24 g的雌性BALB/c裸小鼠10只于無特定病原體(SPF)環(huán)境飼養(yǎng)。將動物隨機分2組，每組5只。分別接種細胞懸液，對照組為未處理AGS細胞；實驗組為轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-β3Gn-T8的AGS細胞。用碘伏消毒受種裸鼠右側(cè)頸部，用1 mL注射器吸取0.2 mL細胞懸液(含有細胞數(shù)>2×106個)接種于皮下，觀察瘤塊成形。每4 d 游標卡尺測量腫瘤體積1 次，28 d 頸椎脫位處死裸鼠，完整剝離瘤體，計算體積，瘤體積=1/2ab2(a為長徑，b為短徑)。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，正態(tài)分布計量資料采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染正義載體后β3Gn-T8的mRNA表達變化

轉(zhuǎn)染β3Gn-T8 正義載體pEGFP-C1-β3Gn-T8后，在24 h、48 h和72 h分別檢測β3Gn-T8的mRNA表達水平。在24 h開始出現(xiàn)β3Gn-T8的mRNA表達的升高，在48 h和72 h仍持續(xù)高表達。與對照組比較，在24 h、48 h和72 h點，β3Gn-T8的 mRNA表達顯著升高(P<0.01)，見圖1。

Figure 1. The mRNA expression of β3Gn-T8 in the AGS cells after transfection with pEGFP-C1-β3Gn-T8. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.
圖1 轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-β3Gn-T8后AGS細胞β3Gn-T8的mRNA表達變化

2 轉(zhuǎn)染正義載體后β3Gn-T8蛋白表達的變化

轉(zhuǎn)染β3Gn-T8 正義載體后，在48 h和72 h，β3Gn-T8蛋白的表達較對照組顯著升高(P<0.01)，見圖2。

Figure 2. The protein expression of β3Gn-T8 in the AGS cells after transfection with pEGFP-C1-β3Gn-T8. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.
圖2 轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-β3Gn-T8后AGS細胞β3Gn-T8蛋白表達的變化

3 β3Gn-T8對AGS細胞增殖的影響

與對照組相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-β3Gn-T8后，24 h、48 h、72 h和96 h AGS細胞的活力明顯增加(P<0.05或P<0.01)。各時點的細胞數(shù)以相對A值(相對于16 h的比值)繪制生長曲線，見圖3。

Figure 3. MTT assay was used to detect the changes in cell viability at different time points (24 h, 48 h, 72 h and 96 h). Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.
圖3 采用MTT實驗在不同時點檢測細胞活力的變化

用臺盼藍染色計算活細胞數(shù)目的實驗中，與對照組比較，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-β3Gn-T8組存活細胞數(shù)量增多(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The viable cells counted by the method of trypan blue exclusion. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.
圖4 臺盼藍活細胞計數(shù)

4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

與對照組相比，pEGFP-C1-β3GnT8組細胞的凋亡率無明顯變化，見圖5。

Figure 5. Flow cytometry was used to detect the apoptotic rate of AGS cells. Mean±SD.n=3.
圖5 流式細胞術(shù)檢測AGS細胞凋亡率

5 移植瘤成瘤時間、體積和重量的變化

對照組在接種后4～5 d 出現(xiàn)肉眼可見的瘤體；pEGFP-c1-β3Gn-T8組在接種瘤細胞后3～4 d長出肉眼可見的瘤體。實驗終止后，對移植瘤的最終體積和最終重量進行比較，pEGFP-C1-β3Gn-T8組的體積和重量均大于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 裸鼠成瘤情況Table 1. Tumor formation in nude mice (Mean±SD. n=5)

*P<0.05vscontrol group.

6 移植瘤生長曲線

以各組移植瘤的體積均值為縱座標，觀察天數(shù)為橫座標，繪制生長曲線圖。比較各組曲線斜率的差異，結(jié)果顯示pEGFP-C1-β3Gn-T8組生長曲線斜率明顯大于對照組(P<0.05)，提示pEGFP-C1β3Gn-T8組腫瘤的生長速度較對照組快，見圖6。

Figure 6. Growth curve of transplanted tumor. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.
圖6 移植瘤生長曲線

討 論

糖基轉(zhuǎn)移酶可以直接改變細胞表面糖基化復合體受體和細胞黏附分子的糖鏈，從而促進或抑制腫瘤細胞的生長。前期研究發(fā)現(xiàn)，β3Gn-T8可促進喉癌Hep-2細胞[4]、白血病HL-60細胞[5]和膠質(zhì)瘤細胞[6]的增殖。胃癌組織中β3Gn-T8表達增加[7]，與胃癌侵襲能力相關(guān)。本文通過上調(diào)該基因的表達研究了其對胃癌細胞的增殖及裸鼠移植瘤的形成的影響。

pEGFP-C1是一種具有熒光蛋白的真核表達載體，能夠穩(wěn)定高表達哺乳動物細胞中插入的外源片段。脂質(zhì)體是一種應用廣泛的非病毒載體，是由雙層結(jié)構(gòu)組成的封閉囊泡，具有良好的生物相容性。它通過內(nèi)吞作用將DNA引入細胞。轉(zhuǎn)染率高，重復性好，包裝容量大，能保護DNA不被核酸酶降解。本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA，在mRNA和蛋白水平成功上調(diào)AGS細胞β3Gn-T8的表達。

增殖異常是腫瘤細胞的重要特征之一。MTT比色法檢測AGS細胞的活力，pEGFP-C1-β3Gn-T8組明顯高于對照組，活細胞計數(shù)顯示pEGFP-C1-β3Gn-T8組顯著高于對照組，以上實驗結(jié)果均提示β3Gn-T8能促進AGS細胞增殖。有報道干擾β3Gn-T8的表達導致白血病細胞K562細胞周期在G1/S期停滯[8]。用流式細胞術(shù)檢測凋亡的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-β3Gn-T8組與對照組的細胞凋亡率的差異無統(tǒng)計學顯著性，說明胃癌細胞的加速生長不是由于細胞凋亡的增加，而是生長速率的增加。

裸鼠致瘤性是檢測細胞惡性特性的方法之一[9]。將pEGFP-C1-β3Gn-T8和對照組2組胃癌細胞接種于裸鼠皮膚下，成瘤率為100%，pEGFP-C1-β3Gn-T8組成瘤時間明顯短于對照組，移植瘤最終體積和重量均顯著大于對照組。比較各組的生長曲線，pEGFP-C1-β3Gn-T8組的斜率明顯高于對照組。上述結(jié)果表明，上調(diào)β3Gn-T8可以促進移植瘤的生長。

有研究報道[10]，胃癌組織β3Gn-T8表達增加，且與胃癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學特性有關(guān)。β3Gn-T8在肝癌的表達增加，且通過改變CD-147蛋白表面的糖鏈結(jié)構(gòu)，影響肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移[3]。垂體腫瘤β3Gn-T8表達增加，且與惡性度正相關(guān)[11]。在130例白血病骨髓樣本中，β3Gn-T8和催化產(chǎn)物多聚乳糖胺鏈表達增加[12]。上述結(jié)果與本文結(jié)果相似，提示β3Gn-T8對腫瘤的惡性生物學行為有重要影響，是潛在的治療靶點。

綜上所述，β3Gn-T8對胃癌AGS細胞的生長有促進作用，促進胃癌AGS細胞的裸鼠移植瘤的成瘤作用。