劉凱,謝楠,馮曉宇,馬恒甲
(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 水產(chǎn)研究所,浙江 杭州 310024)
三角魴(Megalobramaterminalis),隸屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鲌亞科(Culterinae)、魴屬(Megalobrama),分布于中國(guó)嶺南以北各大水系[1]。由于過(guò)度捕撈及生態(tài)環(huán)境變化,三角魴野生資源量嚴(yán)重下降。錢塘江流域由于地方對(duì)三角魴種質(zhì)資源保護(hù)、增殖放流等工作的開(kāi)展,擁有一定的資源量,且建有全國(guó)唯一的國(guó)家級(jí)三角魴原種場(chǎng)[2]。
有關(guān)三角魴的遺傳數(shù)據(jù)較少,因此開(kāi)展遺傳研究對(duì)保護(hù)三角魴至關(guān)重要。微衛(wèi)星是高多態(tài)性的共顯性分子標(biāo)記,是魚(yú)類遺傳多樣性研究的理想分子標(biāo)記[3-5]。有學(xué)者將從團(tuán)頭魴、鳊魚(yú)等開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星引物跨種用于三角魴進(jìn)行遺傳多樣性研究[5-7],但未見(jiàn)有關(guān)三角魴微衛(wèi)星分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)的報(bào)道。
本研究利用探針(CA)10,在三角魴基因組PCR文庫(kù)中,通過(guò)磁珠富集[8]的方法開(kāi)發(fā)了15個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星分子標(biāo)記,該項(xiàng)工作的開(kāi)展將有利于三角魴遺傳多樣性研究,為三角魴的品種選育打下基礎(chǔ)。
三角魴取自杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院水產(chǎn)研究所(國(guó)家級(jí)錢塘江三角魴原種場(chǎng)),采集胸鰭后用無(wú)水乙醇保存?zhèn)溆谩;蚪MDNA采用苯酚-氯仿提取法提取[9],提取后的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶RsaⅠ 37 ℃消化2 h,利用T4-DNA連接酶將接頭21-mer和25-mer[10]與酶切后的DNA片段在25 ℃條件下連接4 h,連接所用接頭由上海桑尼生物科技有限公司合成。用連有接頭的DNA片段作為模板,接頭21-mer作為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,創(chuàng)建基因組PCR文庫(kù)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。
將三角魴基因組PCR文庫(kù)10 μL、10 μmol·L-1生物素標(biāo)記的(CA)10探針1 μL、20×SSC 19.5 μL和雙蒸水34.5 μL混合均勻。98 ℃下變性5 min后,55 ℃下雜交20 min。將雜交完畢的雜交液加入已平衡好的磁珠(每100 μL磁珠,分別用1 mL 1×TE和1 mL 6×SSC洗滌2次,每次5 min,最后用35 μL 6×SSC洗滌后保存?zhèn)溆?,25 ℃溫育30 min,并輕輕搖動(dòng),使生物素和鏈霉親和素結(jié)合。溫育結(jié)束后,將離心管放置到磁力架上,去除溶液。依次用洗液Ⅰ(2×SSC,0.1%SDS)、洗液Ⅱ(1×SSC)洗滌磁珠,去除不含微衛(wèi)星的序列,30 μL雙蒸水洗脫后室溫靜置10 min,釋放出含有微衛(wèi)星序列的單鏈DNA。用所獲得的單鏈DNA作為模板,以21-mer作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物同T-載體(pGEM-T vector,購(gòu)于Promega公司)連接,用大腸埃希菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化,得到三角魴微衛(wèi)星文庫(kù),經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選,挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。
以陽(yáng)性克隆測(cè)序獲得的序列作為參考序列,使用SSR篩選軟件MISA進(jìn)行SSR篩選。篩選標(biāo)準(zhǔn)為1個(gè)堿基重復(fù)10次及10次以上,2個(gè)堿基重復(fù)6次及6次以上,3~6個(gè)堿基重復(fù)5次及5次以上,2個(gè)微衛(wèi)星之間的距離小于100 bp的時(shí)候,2個(gè)微衛(wèi)星組成1個(gè)復(fù)合微衛(wèi)星。用SSR出現(xiàn)頻率和SSR平均分布距離來(lái)描述SSR,出現(xiàn)頻率前2位的重復(fù)單元定義為優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元。計(jì)算公式分別為:SSR出現(xiàn)頻率=搜索到的SSR數(shù)量/EST序列數(shù)量;SSR平均分布頻率=EST序列總堿基數(shù)/搜索到的SSR數(shù)量。
獲得的陽(yáng)性克隆在上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用Primer 3 interface modules對(duì)獲得的陽(yáng)性克隆序列進(jìn)行預(yù)處理后,利用Primer 3進(jìn)行SSR引物的批量設(shè)計(jì),引物設(shè)計(jì)的參數(shù)是Tm為60 ℃,引物長(zhǎng)度為20 bp,所有成功設(shè)計(jì)的引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。將三角魴的基因組DNA樣品作為模板,對(duì)成功設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行TouchDown PCR擴(kuò)增來(lái)初步篩選能擴(kuò)增的引物。采用Hotstart PCR Master Mix試劑盒(購(gòu)自上海近岸科技有限公司)進(jìn)行TouchDown PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s,退火30 s,72 ℃ 20 s,起始退火溫度65 ℃,每個(gè)循環(huán)降低1 ℃,共10個(gè)循環(huán);94 ℃30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃20 s,共20個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。
微衛(wèi)星引物為已初步篩選能擴(kuò)增的引物,由上海桑尼生物科技有限公司合成,上游引物5’端加上FAM熒光標(biāo)記(表1)。利用AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix試劑盒(購(gòu)自Applied Biosystems公司)進(jìn)行TouchDown PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s,退火30 s,72 ℃ 20 s,起始退火溫度65 ℃,每個(gè)循環(huán)降低11 ℃,共10個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃ 20 s,共20個(gè)循環(huán);72 ℃延伸30 min,4 ℃保溫,-20 ℃保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司,通過(guò)ABI Prism3730 xl測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。以LIZ-500為分子量?jī)?nèi)標(biāo),通過(guò)GeneMaker ver. 2.2軟件讀取微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量數(shù)據(jù)。
利用Cervus ver. 3.0.7[11]分析三角魴微衛(wèi)星的等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度,多態(tài)信息含量及進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。其中,Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)采用Yates修正的方差檢驗(yàn)[12],同時(shí)采用Bonferroni修正進(jìn)行顯著性判別[13]。利用Micro-Checker ver. 2.2.3[14]進(jìn)行空等位基因的判別并計(jì)算空等位基因頻率。
本研究中,隨機(jī)篩選陽(yáng)性克隆600個(gè),測(cè)序得到陽(yáng)性克隆367個(gè),其中255個(gè)克隆含有微衛(wèi)星序列。255個(gè)微衛(wèi)星序列中,含有微衛(wèi)星座位355個(gè),其中以AC/GT為單位的重復(fù)序列327個(gè),占微衛(wèi)星座位的92.1%,重復(fù)次數(shù)在20次以上的微衛(wèi)星146個(gè),占總數(shù)的41.1%,10~20次的202個(gè),占總數(shù)的56.9%。
在255個(gè)微衛(wèi)星序列中,除了一些微衛(wèi)星序列因本身結(jié)構(gòu)或兩端太短不能設(shè)計(jì)引物外,其他微衛(wèi)星利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 3.0設(shè)計(jì)引物15對(duì),均為有效引物,具有多態(tài)性(表1)。
15個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星分子標(biāo)記具體信息見(jiàn)表2。等位基因數(shù)量范圍為3~16,觀察雜合度為0.000 0~0.818 2,期望雜合度為0.081 8~0.922 6,多態(tài)信息含量為0.078 9~0.899 9。其中,具有高度多態(tài)性(PIC>0.5)的有6個(gè)標(biāo)記,4個(gè)標(biāo)記具有中度多態(tài)性(0.25 表2 三角魴微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)特征分析 注:Hardy-Weinberg平衡概率值小于經(jīng)Bonferroni修正的P值(P<0.003 6)則判定偏離平衡,計(jì)算時(shí)最小期望頻率值取2,ND表示頻率值偏小而未進(jìn)行Hardy-Weinberg檢驗(yàn)。 本研究中有Mt257、Mt284、Mt301、Mt309、Mt355微衛(wèi)星位點(diǎn)未能進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn),這可能是由于該位點(diǎn)雜合度過(guò)低。Mt153位點(diǎn)未能進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)的原因可能是由于空等位基因頻率過(guò)高。此外,3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離了Hardy-Weinberg平衡,這種情況的發(fā)生可能是由于研究中樣本數(shù)量過(guò)少,該位點(diǎn)上存在基因流動(dòng),即Wahlund效應(yīng)[16]。 利用Micro-Checker 軟件分析表明,樣品中存在空等位基因位點(diǎn)。低頻率空等位基因常常在許多動(dòng)物的微衛(wèi)星研究中發(fā)現(xiàn)[17-18],頻率低于0.2是合理范圍[19]。本研究中,有Mt19、Mt153、Mt246、Mt317、Mt355微衛(wèi)星位點(diǎn)空等位基因頻率高于0.2,可能是由于stutter峰存在或者等位基因丟失而造成的。 本研究報(bào)道了利用磁珠富集法開(kāi)發(fā)的15個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星分子標(biāo)記,這些新分離的分子標(biāo)記將有助于三角魴種群遺傳變異、遺傳結(jié)構(gòu)、種群資源保護(hù)及其他方面的研究。3 討論