劉凱，謝楠，馮曉宇，馬恒甲

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 水產(chǎn)研究所，浙江 杭州 310024)

三角魴(Megalobramaterminalis)，隸屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鲌亞科(Culterinae)、魴屬(Megalobrama)，分布于中國(guó)嶺南以北各大水系[1]。由于過(guò)度捕撈及生態(tài)環(huán)境變化，三角魴野生資源量嚴(yán)重下降。錢塘江流域由于地方對(duì)三角魴種質(zhì)資源保護(hù)、增殖放流等工作的開(kāi)展，擁有一定的資源量，且建有全國(guó)唯一的國(guó)家級(jí)三角魴原種場(chǎng)[2]。

有關(guān)三角魴的遺傳數(shù)據(jù)較少，因此開(kāi)展遺傳研究對(duì)保護(hù)三角魴至關(guān)重要。微衛(wèi)星是高多態(tài)性的共顯性分子標(biāo)記，是魚(yú)類遺傳多樣性研究的理想分子標(biāo)記[3-5]。有學(xué)者將從團(tuán)頭魴、鳊魚(yú)等開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星引物跨種用于三角魴進(jìn)行遺傳多樣性研究[5-7]，但未見(jiàn)有關(guān)三角魴微衛(wèi)星分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)的報(bào)道。

本研究利用探針(CA)10，在三角魴基因組PCR文庫(kù)中，通過(guò)磁珠富集[8]的方法開(kāi)發(fā)了15個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，該項(xiàng)工作的開(kāi)展將有利于三角魴遺傳多樣性研究，為三角魴的品種選育打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 三角魴基因組PCR文庫(kù)構(gòu)建

三角魴取自杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院水產(chǎn)研究所(國(guó)家級(jí)錢塘江三角魴原種場(chǎng))，采集胸鰭后用無(wú)水乙醇保存?zhèn)溆谩；蚪MDNA采用苯酚-氯仿提取法提取[9]，提取后的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶RsaⅠ 37 ℃消化2 h，利用T4-DNA連接酶將接頭21-mer和25-mer[10]與酶切后的DNA片段在25 ℃條件下連接4 h，連接所用接頭由上海桑尼生物科技有限公司合成。用連有接頭的DNA片段作為模板，接頭21-mer作為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，創(chuàng)建基因組PCR文庫(kù)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.2 篩選富集三角魴微衛(wèi)星文庫(kù)

將三角魴基因組PCR文庫(kù)10 μL、10 μmol·L-1生物素標(biāo)記的(CA)10探針1 μL、20×SSC 19.5 μL和雙蒸水34.5 μL混合均勻。98 ℃下變性5 min后，55 ℃下雜交20 min。將雜交完畢的雜交液加入已平衡好的磁珠(每100 μL磁珠，分別用1 mL 1×TE和1 mL 6×SSC洗滌2次，每次5 min，最后用35 μL 6×SSC洗滌后保存?zhèn)溆?，25 ℃溫育30 min，并輕輕搖動(dòng)，使生物素和鏈霉親和素結(jié)合。溫育結(jié)束后，將離心管放置到磁力架上，去除溶液。依次用洗液Ⅰ(2×SSC，0.1%SDS)、洗液Ⅱ(1×SSC)洗滌磁珠，去除不含微衛(wèi)星的序列，30 μL雙蒸水洗脫后室溫靜置10 min，釋放出含有微衛(wèi)星序列的單鏈DNA。用所獲得的單鏈DNA作為模板，以21-mer作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物同T-載體(pGEM-T vector，購(gòu)于Promega公司)連接，用大腸埃希菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到三角魴微衛(wèi)星文庫(kù)，經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。

1.3 三角魴微衛(wèi)星的分析

以陽(yáng)性克隆測(cè)序獲得的序列作為參考序列，使用SSR篩選軟件MISA進(jìn)行SSR篩選。篩選標(biāo)準(zhǔn)為1個(gè)堿基重復(fù)10次及10次以上，2個(gè)堿基重復(fù)6次及6次以上，3～6個(gè)堿基重復(fù)5次及5次以上，2個(gè)微衛(wèi)星之間的距離小于100 bp的時(shí)候，2個(gè)微衛(wèi)星組成1個(gè)復(fù)合微衛(wèi)星。用SSR出現(xiàn)頻率和SSR平均分布距離來(lái)描述SSR，出現(xiàn)頻率前2位的重復(fù)單元定義為優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元。計(jì)算公式分別為：SSR出現(xiàn)頻率=搜索到的SSR數(shù)量/EST序列數(shù)量；SSR平均分布頻率=EST序列總堿基數(shù)/搜索到的SSR數(shù)量。

1.4 三角魴微衛(wèi)星的篩選

獲得的陽(yáng)性克隆在上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用Primer 3 interface modules對(duì)獲得的陽(yáng)性克隆序列進(jìn)行預(yù)處理后，利用Primer 3進(jìn)行SSR引物的批量設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì)的參數(shù)是Tm為60 ℃，引物長(zhǎng)度為20 bp，所有成功設(shè)計(jì)的引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。將三角魴的基因組DNA樣品作為模板，對(duì)成功設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行TouchDown PCR擴(kuò)增來(lái)初步篩選能擴(kuò)增的引物。采用Hotstart PCR Master Mix試劑盒(購(gòu)自上海近岸科技有限公司)進(jìn)行TouchDown PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 20 s，起始退火溫度65 ℃，每個(gè)循環(huán)降低1 ℃，共10個(gè)循環(huán)；94 ℃30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃20 s，共20個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.5 三角魴微衛(wèi)星的分型

微衛(wèi)星引物為已初步篩選能擴(kuò)增的引物，由上海桑尼生物科技有限公司合成，上游引物5’端加上FAM熒光標(biāo)記(表1)。利用AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix試劑盒(購(gòu)自Applied Biosystems公司)進(jìn)行TouchDown PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 20 s，起始退火溫度65 ℃，每個(gè)循環(huán)降低11 ℃，共10個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 20 s，共20個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸30 min，4 ℃保溫，-20 ℃保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司，通過(guò)ABI Prism3730 xl測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。以LIZ-500為分子量?jī)?nèi)標(biāo)，通過(guò)GeneMaker ver. 2.2軟件讀取微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量數(shù)據(jù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Cervus ver. 3.0.7[11]分析三角魴微衛(wèi)星的等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度，多態(tài)信息含量及進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。其中，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)采用Yates修正的方差檢驗(yàn)[12]，同時(shí)采用Bonferroni修正進(jìn)行顯著性判別[13]。利用Micro-Checker ver. 2.2.3[14]進(jìn)行空等位基因的判別并計(jì)算空等位基因頻率。

2 結(jié)果與分析

本研究中，隨機(jī)篩選陽(yáng)性克隆600個(gè)，測(cè)序得到陽(yáng)性克隆367個(gè)，其中255個(gè)克隆含有微衛(wèi)星序列。255個(gè)微衛(wèi)星序列中，含有微衛(wèi)星座位355個(gè)，其中以AC/GT為單位的重復(fù)序列327個(gè)，占微衛(wèi)星座位的92.1%，重復(fù)次數(shù)在20次以上的微衛(wèi)星146個(gè)，占總數(shù)的41.1%，10～20次的202個(gè)，占總數(shù)的56.9%。

在255個(gè)微衛(wèi)星序列中，除了一些微衛(wèi)星序列因本身結(jié)構(gòu)或兩端太短不能設(shè)計(jì)引物外，其他微衛(wèi)星利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 3.0設(shè)計(jì)引物15對(duì)，均為有效引物，具有多態(tài)性(表1)。

15個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星分子標(biāo)記具體信息見(jiàn)表2。等位基因數(shù)量范圍為3～16，觀察雜合度為0.000 0～0.818 2，期望雜合度為0.081 8～0.922 6，多態(tài)信息含量為0.078 9～0.899 9。其中，具有高度多態(tài)性(PIC>0.5)的有6個(gè)標(biāo)記，4個(gè)標(biāo)記具有中度多態(tài)性(0.25

表2 三角魴微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)特征分析

注：Hardy-Weinberg平衡概率值小于經(jīng)Bonferroni修正的P值(P<0.003 6)則判定偏離平衡，計(jì)算時(shí)最小期望頻率值取2，ND表示頻率值偏小而未進(jìn)行Hardy-Weinberg檢驗(yàn)。

3 討論

本研究中有Mt257、Mt284、Mt301、Mt309、Mt355微衛(wèi)星位點(diǎn)未能進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，這可能是由于該位點(diǎn)雜合度過(guò)低。Mt153位點(diǎn)未能進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)的原因可能是由于空等位基因頻率過(guò)高。此外，3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離了Hardy-Weinberg平衡，這種情況的發(fā)生可能是由于研究中樣本數(shù)量過(guò)少，該位點(diǎn)上存在基因流動(dòng)，即Wahlund效應(yīng)[16]。

利用Micro-Checker 軟件分析表明，樣品中存在空等位基因位點(diǎn)。低頻率空等位基因常常在許多動(dòng)物的微衛(wèi)星研究中發(fā)現(xiàn)[17-18]，頻率低于0.2是合理范圍[19]。本研究中，有Mt19、Mt153、Mt246、Mt317、Mt355微衛(wèi)星位點(diǎn)空等位基因頻率高于0.2，可能是由于stutter峰存在或者等位基因丟失而造成的。

本研究報(bào)道了利用磁珠富集法開(kāi)發(fā)的15個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，這些新分離的分子標(biāo)記將有助于三角魴種群遺傳變異、遺傳結(jié)構(gòu)、種群資源保護(hù)及其他方面的研究。