吳夢(mèng)麗 梁嘉俊 魏飛力 楊文龍 杜宇瓊 張秋云

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是在慢性肝病的基礎(chǔ)上發(fā)生急性肝功能衰竭的一組臨床綜合征，病死率極高[1]。在中國(guó)，HBV-ACLF為其最常見(jiàn)類(lèi)型[2]，且目前發(fā)病機(jī)制尚不明確?，F(xiàn)多認(rèn)為肝細(xì)胞大量死亡是ACLF的核心事件，同時(shí)伴肝細(xì)胞增殖障礙致其再生不足[3]。該病目前沒(méi)有特異療法，主要以支持治療和肝移植為主[4]。但有研究顯示ACLF發(fā)生時(shí)肝細(xì)胞可進(jìn)行增殖并修復(fù)肝組織損傷[5]，通過(guò)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞增殖，從而改善肝臟急性損傷是阻止ACLF進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵途徑之一[6]。而轉(zhuǎn)錄因子E2F1是調(diào)控細(xì)胞增殖的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能促使細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換，加快細(xì)胞增殖進(jìn)程[7]。本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)截?cái)嗄嫱旆侥芤种艫CLF模型大鼠肝細(xì)胞的過(guò)度凋亡，促進(jìn)肝細(xì)胞的代償性增殖，極大地減輕并逆轉(zhuǎn)ACLF模型大鼠肝細(xì)胞的損傷[8-10]。本研究在此基礎(chǔ)上利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀(guān)察截?cái)嗄嫱旆胶幯逭{(diào)控E2F1介導(dǎo)的細(xì)胞增殖，減輕D-氨基半乳糖(D-Galactosamine，D-GlaN)誘導(dǎo)的人正常肝細(xì)胞LO2細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及動(dòng)物

LO2細(xì)胞，由首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院肝病實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

雄性Wistar大鼠20只，體重250～280 g，SPF級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部SPF級(jí)動(dòng)物室。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

截?cái)嗄嫱旆浇M成：苦味葉下珠30 g、瓜蔞30 g、金錢(qián)草30 g、生黃芪30 g、槲寄生30 g、三七6 g、莪術(shù)6 g、丹參20 g、生地黃20 g、黑附片先煎15 g，購(gòu)自于北京同仁堂中醫(yī)醫(yī)院藥房，經(jīng)國(guó)醫(yī)大師金世元生藥鑒定。在首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心水煎提取。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[10]，確定中藥組每只大鼠按照體重每日給予21.7 g/(kg·d)中藥劑量效果最佳，水煎液濃縮成4.34 g/mL，盛裝在滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)，4℃冰箱冷藏備用，使用前熱水浸泡，搖勻。

DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))、PBS(HyClone，美國(guó))、胎牛血清(Excell Bio，澳洲)、Cell Counting Kit-8(cck8)(Dojindo，日本)、D-GlaN(Sigma，美國(guó))。Real-time PCR相關(guān)試劑：RNApre Pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒(TIANGEN)、FastKing RT Kit(TIANGEN)、SuperReal PreMix Plus(TIANGEN)均購(gòu)自于天根生化科技有限公司。蛋白印跡法一抗：E2F1 Rabbit mAb(CST，美國(guó))、β-Actin Rabbit mAb(CST，美國(guó))、DP1 Rabbit mAb(CST，美國(guó))。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

低溫離心機(jī)(Heraeus，Biofuge 15r)、酶標(biāo)儀(SpectraMax iD3，美國(guó))、流式細(xì)胞儀(BECKMAN COULTER，美國(guó))、RT PCR儀(BIO-RAD，美國(guó))、垂直電泳槽(Bio-Rad，美國(guó))、Fujifilm成像系統(tǒng)(LAS-3000，日本)。

1.4 方法

1.4.1 含藥血清的制備 Wistar大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組和截?cái)嗄嫱旆浇M，每組10只。灌胃給藥，1 mL/100 g體重/次，每日兩次灌胃?？瞻讓?duì)照組灌服生理鹽水，按照1 mL/100 g體重/次，每日2次。各組連續(xù)3天。末次灌胃2小時(shí)后，麻醉，采集腹主動(dòng)脈血，4℃靜置4小時(shí)，以3000 r/min速度4℃離心30分鐘，吸取上清液，超凈臺(tái)微孔濾膜過(guò)濾除菌，56℃水浴滅活30分鐘，室溫冷卻，標(biāo)記分裝，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 LO2細(xì)胞的培養(yǎng) LO2細(xì)胞復(fù)蘇后置于25 cm培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶添加5 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%左右，按照1∶3比例傳代。

1.4.3 D-GlaN誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷模型 取指數(shù)生長(zhǎng)期的LO2細(xì)胞，以8000個(gè)/孔的細(xì)胞懸液接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時(shí)后，棄舊液。每孔加入100 μL不含血清的培養(yǎng)基饑餓12小時(shí)，以使細(xì)胞周期同步。用含10%FBS的DMEM以100 μL/孔的量加入96孔板培養(yǎng)24小時(shí)后棄舊液。用含10%FBS的培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的D-GlaN工作液(30、60、90、120、150 mmol/L)為實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)不含D-GlaN工作液的為對(duì)照組，無(wú)細(xì)胞的空白組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。D-GlaN工作液分別作用于各組細(xì)胞8小時(shí)后，用PBS洗兩次，然后每孔加入10%的CCK8工作液孵育2小時(shí)后于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各孔的吸光度， 計(jì)算細(xì)胞存活率， 細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%，以篩選出D-GlaN的最合適造模濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 RT-PCR各基因引物序列

1.4.4 分組及給藥 待細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)期時(shí)，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL接種于培養(yǎng)瓶中，隨機(jī)分為5組：正常組、模型組、2.5%JDNWF、5%JDNWF、10%JDNWF。在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12小時(shí)后，吸棄舊培養(yǎng)基，加入無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，以同步各組細(xì)胞周期，12小時(shí)后棄舊液。正常組加入含10%大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基，模型組加入含10%大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基，2.5%JDNWF加入含有2.5%的截?cái)嗄嫱旆胶幯宓腄MEM培養(yǎng)基，5%JDNWF加入含有5%的截?cái)嗄嫱旆胶幯宓腄MEM培養(yǎng)基，不足10%的用空白對(duì)照大鼠血清補(bǔ)足。10%JDNWF加入含有10%的截?cái)嗄嫱旆胶幯宓腄MEM培養(yǎng)基。除正常組外其余各組均加入上述造模濃度的D-GlaN進(jìn)行干預(yù)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 各組細(xì)胞處理后，吸棄舊培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，按照10∶1的比例配制CCK8溶液，每孔110 μL，37℃孵育2小時(shí)后測(cè)定OD值。

1.5.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期 各組細(xì)胞處理后，棄舊液，胰酶適度消化，培養(yǎng)液吹打，800 r/min，離心15分鐘去上清。PBS洗2次，加0.5 mL的PBS吹勻后用力打入5 mL已預(yù)冷的70%乙醇中，4℃固定過(guò)夜。固定后1000 r/min離心5分鐘，棄上清，PBS洗2次，加入1 mL RNAse溶液(20 μg/mL)，37℃反應(yīng)30分鐘后室溫冷卻。加入0.1 mL的PI染液，染色30分鐘后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5.3 Real-Time PCR檢測(cè)各組E2F1、CDK2、cyclin A、cyclinE、CDC25A基因的表達(dá) 各組細(xì)胞處理后，根據(jù)總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。細(xì)胞總RNA提取后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配液，將總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。配制Real Time PCR反應(yīng)液，反應(yīng)條件為95℃(15分鐘)，95℃(10秒)、60℃(20秒)、72℃(30秒)40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后使用，得到樣本目的基因和內(nèi)參CT值，根據(jù)2-△△CT法檢測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列，詳見(jiàn)表1。

1.5.4 Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞DP1蛋白表達(dá)情況 各組細(xì)胞藥物干預(yù)后，棄舊液，PBS洗2次，加入裂解液，裂解10分鐘后刮取細(xì)胞，離心取上清液，蛋白定量后加入適量的Loading Buffer，將其置于金屬浴中，100℃、10分鐘進(jìn)行蛋白變性。配制10%的分離膠和濃縮膠，每個(gè)樣本取20 μg蛋白開(kāi)始上樣電泳，電泳條件為90 V、30分鐘，120 V、60分鐘。電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為300 mA、60分鐘。轉(zhuǎn)膜后剪去目的蛋白和內(nèi)參條帶，以5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉1小時(shí)，TBST清洗3次，每次10分鐘。之后孵育一抗，4℃過(guò)夜。復(fù)溫1小時(shí)后，TBST清洗3次，每次10分鐘。二抗孵育1小時(shí)后TBST清洗3次，每次10分鐘。配制ECL發(fā)光液隨后進(jìn)行蛋白條帶曝光。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CCK8法檢測(cè)D-GlaN對(duì)LO2細(xì)胞活力的影響

CCK8結(jié)果顯示，D-GlaN能夠?qū)е录?xì)胞活性下降，并呈濃度依賴(lài)性。但當(dāng)D-GlaN濃度達(dá)到60 mmol/L時(shí)，細(xì)胞活力下降趨勢(shì)最顯著，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)。此外有研究表明D-GlaN在該濃度條件下可避免肝細(xì)胞壞死并最大限度地引起引起肝細(xì)胞損傷[11]。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用60 mmol/L的D-GlaN濃度作為造模濃度。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 CCK8法檢測(cè)D-GlaN對(duì)LO2細(xì)胞活力的影響

注： 與對(duì)照組相比，aP<0.01。

2.2 CCK8法檢測(cè)各組D-GlaN誘導(dǎo)LO2細(xì)胞存活率比較

CCK8結(jié)果顯示，與模型組相比，不同濃度截?cái)嗄嫱旆胶幯褰M的細(xì)胞存活率均有所升高(P<0.05，P<0.01)，但含藥血清濃度為5%時(shí)細(xì)胞存活率升高幅度最大。這表明截?cái)嗄嫱旆胶幯迥茉鰪?qiáng)LO2細(xì)胞活力，改善肝細(xì)胞損傷情況，但以5%濃度的含藥血清效果最佳。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組D-GlaN誘導(dǎo)LO2細(xì)胞存活率比較

注： 與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

2.3 各組D-GlaN誘導(dǎo)LO2細(xì)胞周期比較

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，模型組較正常組G1期比例明顯減少(P<0.05)，但是S期和G2期無(wú)明顯變化。截?cái)嗄嫱旆胶幯褰M較模型組G1期細(xì)胞比例明顯增加(P<0.05，P<0.01)。2.5%JDNWF組與模型組比較，S期和G2/M期細(xì)胞比例無(wú)明顯變化。5%JDNWF和10%JDNWF組與模型組比較，S期和G2/M期細(xì)胞比例均顯著增加(P<0.01)，但5%JDNWF組S期細(xì)胞比例較10%JDNWF組增加更加明顯。這提示截?cái)嗄嫱旆胶幯蹇杉涌旒?xì)胞進(jìn)入G1期的進(jìn)程，并且濃度越高，細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)換的進(jìn)程越快。見(jiàn)圖1和表4。

組別nG0/G1(%)S(%)G2/M(%)正常組348.07±1.3143.53±0.748.42±1.51模型組351.70±0.90a39.47±1.768.82±0.862.5%JDNWF346.73±2.40c43.00±3.4610.26±1.555%JDNWF335.23±3.18d53.13±5.18d11.62±2.03d10%JDNWF340.5±0.95d47.83±0.06d11.66±0.98d

注： 與正常組相比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組相比，cP<0.05，

dP<0.01。

2.4 各組D-GlaN誘導(dǎo)LO2細(xì)胞E2F1、cyclin E、cyclin A、CDK2、CDC25A mRNA表達(dá)的影響

PCR結(jié)果顯示，模型組E2F1、cyclin E、cyclin A、CDK2、CDC25A mRNA與正常組相比表達(dá)均下降，差異顯著(P<0.01)。截?cái)嗄嫱旆胶幯褰ME2F1、cyclin E、cyclin A、CDK2、CDC25A mRNA與模型組相比表達(dá)均上調(diào)，差異顯著(P<0.01)；但以5%的截?cái)嗄嫱旆胶幯褰M各基因的mRNA表達(dá)上調(diào)最明顯。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 各組D-GlaN誘導(dǎo)LO2細(xì)胞E2F1、cyclin E、cyclin A、CDK2、CDC25A mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

注： 與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

2.5 Western Blot檢測(cè)截?cái)嗄嫱旆胶幯鍖?duì)D-GlaN誘導(dǎo)LO2細(xì)胞DP1蛋白表達(dá)情況

Western Blot結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組DP1表達(dá)量有所下降(P<0.01)；與模型組相比，截?cái)嗄嫱旆胶幯褰MDP1表達(dá)量均有所上升(P<0.05，P<0.01)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)圖2和表6。

注：A：正常組；B：模型組；C：2.5%JDNWF；D：5%JDNWF；E：10%JDNWF

圖2 各組D-GlaN誘導(dǎo)LO2細(xì)胞DP1蛋白 表達(dá)免疫印跡電泳表6 各組D-GlaN誘導(dǎo)LO2細(xì)胞DP1蛋白的 相對(duì)表達(dá)量(IOD值)

注： 與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

3 討論

現(xiàn)代研究表明慢加急性肝衰竭的病理特點(diǎn)是大量的肝臟細(xì)胞壞死、過(guò)多凋亡和再生不足[12]，該病西醫(yī)目前尚無(wú)有效的治療手段。截?cái)嗄嫱旆绞侨珖?guó)名中醫(yī)錢(qián)英教授根據(jù)ACLF“毒瘀和正虛交織”的病機(jī)特點(diǎn)擬定的基礎(chǔ)方[13]，全方由苦味葉下珠、瓜蔞、金錢(qián)草、生黃芪等組成，共奏清熱解毒、涼血化瘀、調(diào)補(bǔ)氣血陰陽(yáng)之效，早期快速截?cái)嗖?shì)，同時(shí)固護(hù)人體氣血，扭轉(zhuǎn)危局[14]。臨床研究發(fā)現(xiàn)該方能在一定程度上改善肝功能、降低病死率[15]，而且課題組前期進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明該方能降低ACLF模型大鼠的炎癥因子如白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子-α水平，保護(hù)肝功能，減輕肝細(xì)胞損傷[8-10]，但具體機(jī)制不清。本實(shí)驗(yàn)中，CCK8法檢測(cè)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)截?cái)嗄嫱旆胶幯迥茱@著增強(qiáng)肝細(xì)胞活力，進(jìn)一步表明該方能保護(hù)肝細(xì)胞并逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞損傷。

此外，在實(shí)驗(yàn)中還觀(guān)察到明顯的肝細(xì)胞增殖現(xiàn)象。既往的研究顯示，肝臟未處于病理狀態(tài)時(shí)，肝細(xì)胞處于G0期。當(dāng)ACLF發(fā)生時(shí)，各種刺激性因素作用于肝臟，則會(huì)進(jìn)一步出現(xiàn)肝細(xì)胞的壞死和過(guò)度凋亡，同時(shí)會(huì)刺激殘存的肝細(xì)胞重新進(jìn)入增殖狀態(tài)來(lái)延緩肝臟損傷速度，恢復(fù)肝功能。但是，一旦肝細(xì)胞壞死超過(guò)肝細(xì)胞的再生能力時(shí)則會(huì)引起肝功能急劇惡化導(dǎo)致肝衰竭的發(fā)生。因此結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)逆挽方保護(hù)肝細(xì)胞的作用可能系其促進(jìn)肝細(xì)胞增殖所致。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，發(fā)現(xiàn)截?cái)嗄嫱旆胶幯褰M能促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換。肝臟未處于病理狀態(tài)時(shí)，肝細(xì)胞處于G0期，而E2F1作為轉(zhuǎn)錄激活子，通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活細(xì)胞周期蛋白如cyclin E、cyclin A、cyclin D的表達(dá)等促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。但是E2F1只有與DP1結(jié)合形成E2F1/DP1二聚體時(shí)才能發(fā)揮激活下游基因轉(zhuǎn)錄的作用，使細(xì)胞順利通過(guò)S期[16]。當(dāng)靜止期細(xì)胞重新進(jìn)入增殖期時(shí)，E2F1/DP1正反饋調(diào)節(jié)下游細(xì)胞周期的關(guān)鍵基因cyclin E、cyclin A的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)入S期所需的蛋白質(zhì)。而這些周期蛋白只有與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)如CDK4/6、CDK2結(jié)合形成活性復(fù)合物才能發(fā)揮其功能，同時(shí)這些活性復(fù)合物的形成又依賴(lài)于雙特異性磷酸酶CDC25A對(duì)CDK的去磷酸化[17-19]。在G1晚期cyclin E/CDK2表達(dá)達(dá)到峰值，活性最強(qiáng)，啟動(dòng)DNA的生物合成，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。并且有研究表明若E2F1轉(zhuǎn)錄因子活性降低可能會(huì)導(dǎo)致cyclin E和CDC25A的表達(dá)下調(diào)而使細(xì)胞增殖處于停滯狀態(tài)[20]。因此E2F1介導(dǎo)的增殖信號(hào)通路是啟動(dòng)肝細(xì)胞增殖，加快細(xì)胞增殖進(jìn)程的關(guān)鍵通路。逆挽方不僅能在基因水平上調(diào)LO2細(xì)胞E2F1 mRNA的表達(dá)， 而且各組細(xì)胞cyclin E、cyclin A、CDK2、CDC25A mRNA的表達(dá)也有所增加，另外在蛋白水平上也證實(shí)該方能上調(diào)DP1的表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明截?cái)嗄嫱旆侥芡ㄟ^(guò)刺激LO2細(xì)胞中E2F1的表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活細(xì)胞增殖所需的各種因子，加快肝細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。由此表明，通過(guò)介導(dǎo)E2F1增殖信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，減輕D-GlaN誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞損傷可能是截?cái)嗄嫱旆奖Ｗo(hù)肝細(xì)胞的關(guān)鍵機(jī)制之一。

截?cái)嗄嫱旆绞墙M方藥味多、成分復(fù)雜的復(fù)方，故其含藥血清于體外作用于D-GlaN誘導(dǎo)損傷LO2細(xì)胞，可作用于E2F1、cyclin E、cyclin A以及CDC25A等各個(gè)環(huán)節(jié)，極大促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，保護(hù)肝功能，為臨床推廣使用該方提供理論依據(jù)。