劉藝 王瑞昕 游龍?zhí)?董曉旭

斑馬魚(yú)與人類基因同源性高達(dá)85%，擁有廣泛的細(xì)胞色素P450酶參與代謝反應(yīng)，包括氧化、羥基化、接合、去甲基化和甲基化[1-3]，能體現(xiàn)Ⅰ相、Ⅱ相、腸菌及多途徑代謝的綜合結(jié)果。另具有飼養(yǎng)成本低、體外受精、透明易觀察、單次產(chǎn)卵數(shù)較高等特點(diǎn)[4-5]。目前斑馬魚(yú)已被美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院列為繼人和鼠之后的第三大模式生物，可以快速篩選藥物和定量評(píng)價(jià)待測(cè)化合物的肝毒性作用。

大黃為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃RheumoffcihaleBaill.的干燥根和根莖，具有瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)的功效[6-7]。然而, 近年有報(bào)道大黃中成分對(duì)機(jī)體的肝功能有不良影響，長(zhǎng)期應(yīng)用可能引起肝損傷，推測(cè)蘆薈大黃素可能為肝毒性成分之一[8-10]。另有研究表明蘆薈大黃素能明顯誘導(dǎo)動(dòng)物肝細(xì)胞發(fā)生DNA損傷[11]，但蘆薈大黃素的體內(nèi)致肝毒性作用機(jī)制尚未明確。因此，本研究中利用斑馬魚(yú)獨(dú)特的生理結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)，通過(guò)觀察不同濃度蘆薈大黃素處理后斑馬魚(yú)生存率，確定10%致死濃度(10% lethal concentration，LC10)與最大非致死濃度(maximum non-lethal concentration，MNLC)；進(jìn)而研究斑馬魚(yú)肝臟形態(tài)、肝臟不透光度平均值，卵黃囊吸收延遲面積的影響。最后，對(duì)斑馬魚(yú)CYP450酶，凋亡相關(guān)蛋白等進(jìn)行檢測(cè)，探討蘆薈大黃素致肝毒性的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型AB品系斑馬魚(yú)，以自然成對(duì)交配繁殖方式進(jìn)行。以上斑馬魚(yú)均飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚(yú)用水中(水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510 μS/cm；pH為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3)。飼養(yǎng)管理符合國(guó)際實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理評(píng)估和認(rèn)證協(xié)會(huì)(AAALAC)認(rèn)證的要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥、試劑與儀器

蘆薈大黃素購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：111573，純度>98.0%)；甲基纖維素購(gòu)自Sigma(China)公司 (批號(hào)：9004-67-5) ；二甲基亞砜購(gòu)自Sigma(China)公司 (批號(hào)：67-68-5)。Caspase3試劑盒(批號(hào)：0000273306)；Caspase9試劑盒(批號(hào)：0000271121)；CYP3A4試劑盒(批號(hào)：0000269999)均購(gòu)自Promega公司。

解剖顯微鏡(SZX7，OLYMPUS，Japan)；與顯微鏡相連的相機(jī)(VertA1)；精密電子天平(CP214，奧豪斯)；6孔板(Fisher Scientific，China)；多功能酶標(biāo)儀(LB940，Berthold Technologies，Germany)；96孔酶標(biāo)板(Corning Incorporated，USA)。

1.3 蘆薈大黃素儲(chǔ)備液的制備

稱取適量蘆薈大黃素，用DMSO配制成一定濃度的藥物儲(chǔ)備液，-20℃保存，實(shí)驗(yàn)前用養(yǎng)魚(yú)水稀釋，制備成的最終工作液中DMSO濃度不超過(guò)1%。

1.4 MNLC和LC10測(cè)定

隨機(jī)選取270尾受精后3天(3 dpf)野生型AB品系斑馬魚(yú)于六孔板中，每孔(實(shí)驗(yàn)組)均放置30尾斑馬魚(yú)，水溶給予藥物濃度分別為100、200、300、400、600、800和1000 μM，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組(養(yǎng)魚(yú)用水處理斑馬魚(yú))和溶劑對(duì)照組(1% DMSO)。每天統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚(yú)死亡數(shù)量并及時(shí)移除，處理48小時(shí)后，觀察記錄每個(gè)實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)的死亡情況，計(jì)算其死亡率(%)，用OriginPro 8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件繪制最佳的“死亡率-濃度”效應(yīng)曲線，計(jì)算蘆薈大黃素對(duì)斑馬魚(yú)肝臟毒性的MNLC和LC10。

1.5 斑馬魚(yú)肝臟毒性評(píng)價(jià)

隨機(jī)選取120尾受精后3天(3 dpf)野生型AB品系斑馬魚(yú)于6孔板中，實(shí)驗(yàn)組每孔均放30尾斑馬魚(yú)，分別水溶給予藥物MNLC/3和MNLC濃度，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和溶劑對(duì)照組。用藥物處理斑馬魚(yú)48小時(shí)后，每個(gè)實(shí)驗(yàn)(濃度)組隨機(jī)選取10尾斑馬魚(yú)在解剖顯微鏡下拍照，用NIS-Elements D 3.10高級(jí)圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析并采集數(shù)據(jù)，計(jì)算斑馬魚(yú)肝臟面積、肝臟不透光度平均值和卵黃囊吸收延遲面積。

1.6 斑馬魚(yú)細(xì)胞色素P450檢測(cè)

隨機(jī)選取120尾受精后3天(3 dpf)野生型AB品系斑馬魚(yú)于6孔板中，每孔(實(shí)驗(yàn)組)均放30尾斑馬魚(yú)，分別水溶給予藥物MNLC/3和MNLC濃度，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和溶劑對(duì)照組。蘆薈大黃素處理斑馬魚(yú)48小時(shí)后，加入CYP試劑盒檢測(cè)CYP 3A4的活性，應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀分析統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)相對(duì)發(fā)光單位(relative luminescence units，RLU)信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)行定量分析。

1.7 斑馬魚(yú)凋亡蛋白檢測(cè)

隨機(jī)選取120尾受精后3天(3 dpf)野生型AB品系斑馬魚(yú)于6孔板中，實(shí)驗(yàn)組每孔均放30尾斑馬魚(yú)，分別水溶給予供試品MNLC/3和MNLC濃度，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和溶劑對(duì)照組。藥物處理斑馬魚(yú)48小時(shí)后，用Caspase試劑盒檢測(cè)與凋亡相關(guān)的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族的Caspase3和Caspase9的活性，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)RLU信號(hào)強(qiáng)度，評(píng)價(jià)藥物各濃度對(duì)斑馬魚(yú)Caspase3和Caspase9活性的影響。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 蘆薈大黃素對(duì)斑馬魚(yú)的MNLC和LC10

蘆薈大黃素在300、400、600、800和1000 μM濃度條件下，分別誘發(fā)2/30、15/30、27/30、29/30和30/30尾斑馬魚(yú)死亡，死亡率分別為6.7%、50%、90%、96.7%和100%。藥物MNLC和LC10“死亡率-濃度”數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。用OriginPro 8.0軟件擬合濃度-致死曲線(圖1)，經(jīng)過(guò)曲線擬合，求得：蘆薈大黃素對(duì)斑馬魚(yú)的LC10為312 μM，MNLC為229 μM。在后續(xù)肝毒性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置了1/3MNLC與MNLC為各給藥組。

2.2 蘆薈大黃素對(duì)斑馬魚(yú)肝臟毒性結(jié)果

與斑馬魚(yú)正常對(duì)照組(18631像素)相比，溶劑對(duì)照組的斑馬魚(yú)肝臟面積(18627像素)并未見(jiàn)顯著差異(P>0.05)，表明空白溶劑對(duì)斑馬魚(yú)肝臟面積無(wú)影響。與溶劑對(duì)照組相比，各給藥組(76.3 μM和229 μM)的斑馬魚(yú)肝臟面積分別為18204和18331像素，未見(jiàn)顯著差異(P>0.05)，表明蘆薈大黃素在該濃度內(nèi)對(duì)斑馬魚(yú)肝臟面積無(wú)明顯影響。

表1 蘆薈大黃素對(duì)斑馬魚(yú)的MNLC和LC10

圖1 蘆薈大黃素對(duì)斑馬魚(yú)的致死率

與斑馬魚(yú)正常對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組斑馬魚(yú)肝臟不透光度平均值未見(jiàn)顯著差異，表明空白溶劑對(duì)斑馬魚(yú)肝臟變性無(wú)影響。與溶劑對(duì)照組相比，各給藥組(76.3 μM和229 μM)的斑馬魚(yú)肝臟不透光度平均值有顯著性差異(P<0.001)，表明蘆薈大黃素在該濃度內(nèi)可誘發(fā)斑馬魚(yú)肝臟變性。

與斑馬魚(yú)正常對(duì)照組(2141)相比，溶劑對(duì)照組斑馬魚(yú)卵黃囊吸收延遲面積(1772像素)未見(jiàn)顯著差異，表明空白溶劑對(duì)斑馬魚(yú)卵黃囊吸收無(wú)影響。與溶劑對(duì)照組相比，各給藥組(76.3 μM和229 μM)的斑馬魚(yú)卵黃囊吸收延遲面積分別為14608和41478像素，有顯著性差異(P<0.05，P<0.001)，表明蘆薈大黃素在該濃度內(nèi)可誘發(fā)斑馬魚(yú)卵黃囊吸收延遲(表2、圖2)。

表2 蘆薈大黃素對(duì)斑馬魚(yú)肝臟的影響

注：與溶劑對(duì)照組比較，aP< 0.05。

注：L:肝臟；Y:卵黃囊。

圖2斑馬魚(yú)暴露蘆薈大黃素后肝毒性的視覺(jué)表型

2.3 蘆薈大黃素對(duì)CYP450酶的影響

CYP450 3A4約占人體肝臟CYP450的30%～40%，有近50%的藥物通過(guò)它進(jìn)行代謝[12]。結(jié)果顯示：溶劑對(duì)照組斑馬魚(yú)CYP3A4 RLU的活性(4006)與正常對(duì)照組(4251)比較，P>0.05，提示1% DMSO對(duì)斑馬魚(yú)細(xì)胞色素P450(CYP)活性無(wú)影響。MNLC/3濃度組斑馬魚(yú)CYP 3A4 RLU的活性為3100,MNLC濃度組斑馬魚(yú)CYP3A4 RLU的活性為2887,表明蘆薈大黃素對(duì)斑馬魚(yú)CYP 3A4有顯著的抑制作用。見(jiàn)表3。

表3 蘆薈大黃素對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi) CYP450 3A4活力的影響

注： 與溶劑對(duì)照組比較，aP<0.05。

2.4 蘆薈大黃素對(duì)斑馬魚(yú)凋亡蛋白的影響

蘆薈大黃素處理斑馬魚(yú)后，分別對(duì)各實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚(yú)體內(nèi)的凋亡通路相關(guān)蛋白酶Caspase3和Caspase9的活性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示：溶劑對(duì)照組的斑馬魚(yú)Caspase3和Caspase9活性與正常對(duì)照組相比，P>0.05，說(shuō)明空白溶劑對(duì)斑馬魚(yú)Caspase3和Caspase9無(wú)影響。另外，各給藥組(76.3 μM和229 μM)斑馬魚(yú)Caspase3和Caspase9活性均顯著高于溶劑對(duì)照組，且呈現(xiàn)明顯劑量依賴關(guān)系。表明蘆薈大黃素能上調(diào)Caspase9蛋白，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致Caspase3酶表達(dá)升高，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。見(jiàn)表4、表5。

表4 蘆薈大黃素對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi) Caspase3蛋白的影響

注： 與溶劑對(duì)照組比較，aP<0.05。

表5 蘆薈大黃素對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi) Caspase9蛋白的影響

注： 與溶劑對(duì)照組比較，aP<0.05。

3 討論

斑馬魚(yú)因與人基因同源高、樣本量大、具有體外受精和胚胎透明、易于養(yǎng)殖和活體觀察、方便控制實(shí)驗(yàn)條件和檢測(cè)等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于疾病模型的建立和藥物篩選中[13]。關(guān)于斑馬魚(yú)在肝臟領(lǐng)域的研究報(bào)道逐漸增多，已經(jīng)建立了酒精性脂肪肝、藥物性肝損害和肝癌模型[14-17]。張?jiān)频萚18]研究了不同濃度對(duì)乙酰氨基酚對(duì)肝臟熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)幼魚(yú)的肝臟毒性，經(jīng)對(duì)乙酰氨基酚處理后肝臟顏色變暗，卵黃囊腫，肝臟組織的 L-FABP 熒光表達(dá)下降，肝臟出現(xiàn)萎縮。 He等[19]用斑馬魚(yú)評(píng)價(jià)6種已知對(duì)人有肝毒性的藥物以及2種無(wú)肝毒性藥物的肝毒性，評(píng)價(jià)指標(biāo)為：肝變性、肝腫大(萎縮)以及卵黃囊吸收延遲(意味著肝功能受到影響)。單盲法評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，斑馬魚(yú)評(píng)價(jià)結(jié)果預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為100%，組織病理學(xué)分析證實(shí)了斑馬魚(yú)表型觀察對(duì)藥物肝毒性預(yù)測(cè)的可靠性。目前，美國(guó)FDA和歐洲EMA已經(jīng)接受用斑馬魚(yú)肝毒性評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)進(jìn)行藥物臨床申報(bào)。

本研究通過(guò)觀察不同濃度蘆薈大黃素(100～1000 μM)暴露后斑馬魚(yú)的一般情況，如生存率與表型等，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，斑馬魚(yú)生存率顯著下降，呈現(xiàn)明顯劑量反應(yīng)關(guān)系。肝臟毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)顯示，蘆薈大黃素(76.3 μM、229 μM)未明顯改變斑馬魚(yú)的肝臟面積，但隨著蘆薈大黃素濃度增大，斑馬魚(yú)的肝臟不透光度增加及卵黃囊吸收延遲面積增大。蘆薈大黃素對(duì)斑馬魚(yú)CYP 3A4酶有顯著的抑制作用，呈現(xiàn)明顯劑量—反應(yīng)關(guān)系。ELISA結(jié)果表明，蘆薈大黃素(76.3 μM、229 μM)能顯著上調(diào)Caspase9蛋白水平，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致Caspase3酶表達(dá)升高，誘導(dǎo)斑馬魚(yú)肝細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蘆薈大黃素能誘導(dǎo)斑馬魚(yú)肝毒性發(fā)生，作用機(jī)制可能與蘆薈大黃素激活凋亡相關(guān)蛋白，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，并且誘導(dǎo)斑馬魚(yú)Ⅰ相代謝酶的異常表達(dá)相關(guān)。