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        蘆薈大黃素誘導斑馬魚肝毒性及作用機制研究

        2020-02-06 11:48:50劉藝王瑞昕游龍?zhí)?/span>董曉旭
        環(huán)球中醫(yī)藥 2020年1期
        關鍵詞:蘆薈斑馬魚黃素

        劉藝 王瑞昕 游龍?zhí)?董曉旭

        斑馬魚與人類基因同源性高達85%,擁有廣泛的細胞色素P450酶參與代謝反應,包括氧化、羥基化、接合、去甲基化和甲基化[1-3],能體現(xiàn)Ⅰ相、Ⅱ相、腸菌及多途徑代謝的綜合結果。另具有飼養(yǎng)成本低、體外受精、透明易觀察、單次產(chǎn)卵數(shù)較高等特點[4-5]。目前斑馬魚已被美國國家衛(wèi)生研究院列為繼人和鼠之后的第三大模式生物,可以快速篩選藥物和定量評價待測化合物的肝毒性作用。

        大黃為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃RheumoffcihaleBaill.的干燥根和根莖,具有瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)的功效[6-7]。然而, 近年有報道大黃中成分對機體的肝功能有不良影響,長期應用可能引起肝損傷,推測蘆薈大黃素可能為肝毒性成分之一[8-10]。另有研究表明蘆薈大黃素能明顯誘導動物肝細胞發(fā)生DNA損傷[11],但蘆薈大黃素的體內(nèi)致肝毒性作用機制尚未明確。因此,本研究中利用斑馬魚獨特的生理結構優(yōu)勢,通過觀察不同濃度蘆薈大黃素處理后斑馬魚生存率,確定10%致死濃度(10% lethal concentration,LC10)與最大非致死濃度(maximum non-lethal concentration,MNLC);進而研究斑馬魚肝臟形態(tài)、肝臟不透光度平均值,卵黃囊吸收延遲面積的影響。最后,對斑馬魚CYP450酶,凋亡相關蛋白等進行檢測,探討蘆薈大黃素致肝毒性的作用機制。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物

        野生型AB品系斑馬魚,以自然成對交配繁殖方式進行。以上斑馬魚均飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚用水中(水質(zhì):每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽,電導率為480~510 μS/cm;pH為6.9~7.2;硬度為53.7~71.6 mg/L CaCO3)。飼養(yǎng)管理符合國際實驗室動物護理評估和認證協(xié)會(AAALAC)認證的要求。

        1.2 實驗用藥、試劑與儀器

        蘆薈大黃素購自上海詩丹德生物技術有限公司(批號:111573,純度>98.0%);甲基纖維素購自Sigma(China)公司 (批號:9004-67-5) ;二甲基亞砜購自Sigma(China)公司 (批號:67-68-5)。Caspase3試劑盒(批號:0000273306);Caspase9試劑盒(批號:0000271121);CYP3A4試劑盒(批號:0000269999)均購自Promega公司。

        解剖顯微鏡(SZX7,OLYMPUS,Japan);與顯微鏡相連的相機(VertA1);精密電子天平(CP214,奧豪斯);6孔板(Fisher Scientific,China);多功能酶標儀(LB940,Berthold Technologies,Germany);96孔酶標板(Corning Incorporated,USA)。

        1.3 蘆薈大黃素儲備液的制備

        稱取適量蘆薈大黃素,用DMSO配制成一定濃度的藥物儲備液,-20℃保存,實驗前用養(yǎng)魚水稀釋,制備成的最終工作液中DMSO濃度不超過1%。

        1.4 MNLC和LC10測定

        隨機選取270尾受精后3天(3 dpf)野生型AB品系斑馬魚于六孔板中,每孔(實驗組)均放置30尾斑馬魚,水溶給予藥物濃度分別為100、200、300、400、600、800和1000 μM,同時設置正常對照組(養(yǎng)魚用水處理斑馬魚)和溶劑對照組(1% DMSO)。每天統(tǒng)計各實驗組的斑馬魚死亡數(shù)量并及時移除,處理48小時后,觀察記錄每個實驗組斑馬魚的死亡情況,計算其死亡率(%),用OriginPro 8.0統(tǒng)計學軟件繪制最佳的“死亡率-濃度”效應曲線,計算蘆薈大黃素對斑馬魚肝臟毒性的MNLC和LC10。

        1.5 斑馬魚肝臟毒性評價

        隨機選取120尾受精后3天(3 dpf)野生型AB品系斑馬魚于6孔板中,實驗組每孔均放30尾斑馬魚,分別水溶給予藥物MNLC/3和MNLC濃度,同時設置正常對照組和溶劑對照組。用藥物處理斑馬魚48小時后,每個實驗(濃度)組隨機選取10尾斑馬魚在解剖顯微鏡下拍照,用NIS-Elements D 3.10高級圖像處理軟件進行圖像分析并采集數(shù)據(jù),計算斑馬魚肝臟面積、肝臟不透光度平均值和卵黃囊吸收延遲面積。

        1.6 斑馬魚細胞色素P450檢測

        隨機選取120尾受精后3天(3 dpf)野生型AB品系斑馬魚于6孔板中,每孔(實驗組)均放30尾斑馬魚,分別水溶給予藥物MNLC/3和MNLC濃度,同時設置正常對照組和溶劑對照組。蘆薈大黃素處理斑馬魚48小時后,加入CYP試劑盒檢測CYP 3A4的活性,應用多功能酶標儀分析統(tǒng)計各實驗組斑馬魚相對發(fā)光單位(relative luminescence units,RLU)信號強度,進行定量分析。

        1.7 斑馬魚凋亡蛋白檢測

        隨機選取120尾受精后3天(3 dpf)野生型AB品系斑馬魚于6孔板中,實驗組每孔均放30尾斑馬魚,分別水溶給予供試品MNLC/3和MNLC濃度,同時設置正常對照組和溶劑對照組。藥物處理斑馬魚48小時后,用Caspase試劑盒檢測與凋亡相關的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族的Caspase3和Caspase9的活性,通過酶標儀檢測RLU信號強度,評價藥物各濃度對斑馬魚Caspase3和Caspase9活性的影響。

        1.8 統(tǒng)計學處理

        2 結果

        2.1 蘆薈大黃素對斑馬魚的MNLC和LC10

        蘆薈大黃素在300、400、600、800和1000 μM濃度條件下,分別誘發(fā)2/30、15/30、27/30、29/30和30/30尾斑馬魚死亡,死亡率分別為6.7%、50%、90%、96.7%和100%。藥物MNLC和LC10“死亡率-濃度”數(shù)據(jù)見表1。用OriginPro 8.0軟件擬合濃度-致死曲線(圖1),經(jīng)過曲線擬合,求得:蘆薈大黃素對斑馬魚的LC10為312 μM,MNLC為229 μM。在后續(xù)肝毒性評價實驗中,設置了1/3MNLC與MNLC為各給藥組。

        2.2 蘆薈大黃素對斑馬魚肝臟毒性結果

        與斑馬魚正常對照組(18631像素)相比,溶劑對照組的斑馬魚肝臟面積(18627像素)并未見顯著差異(P>0.05),表明空白溶劑對斑馬魚肝臟面積無影響。與溶劑對照組相比,各給藥組(76.3 μM和229 μM)的斑馬魚肝臟面積分別為18204和18331像素,未見顯著差異(P>0.05),表明蘆薈大黃素在該濃度內(nèi)對斑馬魚肝臟面積無明顯影響。

        表1 蘆薈大黃素對斑馬魚的MNLC和LC10

        圖1 蘆薈大黃素對斑馬魚的致死率

        與斑馬魚正常對照組相比,溶劑對照組斑馬魚肝臟不透光度平均值未見顯著差異,表明空白溶劑對斑馬魚肝臟變性無影響。與溶劑對照組相比,各給藥組(76.3 μM和229 μM)的斑馬魚肝臟不透光度平均值有顯著性差異(P<0.001),表明蘆薈大黃素在該濃度內(nèi)可誘發(fā)斑馬魚肝臟變性。

        與斑馬魚正常對照組(2141)相比,溶劑對照組斑馬魚卵黃囊吸收延遲面積(1772像素)未見顯著差異,表明空白溶劑對斑馬魚卵黃囊吸收無影響。與溶劑對照組相比,各給藥組(76.3 μM和229 μM)的斑馬魚卵黃囊吸收延遲面積分別為14608和41478像素,有顯著性差異(P<0.05,P<0.001),表明蘆薈大黃素在該濃度內(nèi)可誘發(fā)斑馬魚卵黃囊吸收延遲(表2、圖2)。

        表2 蘆薈大黃素對斑馬魚肝臟的影響

        注:與溶劑對照組比較,aP< 0.05。

        注:L:肝臟;Y:卵黃囊。

        圖2斑馬魚暴露蘆薈大黃素后肝毒性的視覺表型

        2.3 蘆薈大黃素對CYP450酶的影響

        CYP450 3A4約占人體肝臟CYP450的30%~40%,有近50%的藥物通過它進行代謝[12]。結果顯示:溶劑對照組斑馬魚CYP3A4 RLU的活性(4006)與正常對照組(4251)比較,P>0.05,提示1% DMSO對斑馬魚細胞色素P450(CYP)活性無影響。MNLC/3濃度組斑馬魚CYP 3A4 RLU的活性為3100,MNLC濃度組斑馬魚CYP3A4 RLU的活性為2887,表明蘆薈大黃素對斑馬魚CYP 3A4有顯著的抑制作用。見表3。

        表3 蘆薈大黃素對斑馬魚體內(nèi) CYP450 3A4活力的影響

        注: 與溶劑對照組比較,aP<0.05。

        2.4 蘆薈大黃素對斑馬魚凋亡蛋白的影響

        蘆薈大黃素處理斑馬魚后,分別對各實驗組的斑馬魚體內(nèi)的凋亡通路相關蛋白酶Caspase3和Caspase9的活性進行了檢測。結果顯示:溶劑對照組的斑馬魚Caspase3和Caspase9活性與正常對照組相比,P>0.05,說明空白溶劑對斑馬魚Caspase3和Caspase9無影響。另外,各給藥組(76.3 μM和229 μM)斑馬魚Caspase3和Caspase9活性均顯著高于溶劑對照組,且呈現(xiàn)明顯劑量依賴關系。表明蘆薈大黃素能上調(diào)Caspase9蛋白,引發(fā)級聯(lián)反應,導致Caspase3酶表達升高,誘導肝細胞凋亡。見表4、表5。

        表4 蘆薈大黃素對斑馬魚體內(nèi) Caspase3蛋白的影響

        注: 與溶劑對照組比較,aP<0.05。

        表5 蘆薈大黃素對斑馬魚體內(nèi) Caspase9蛋白的影響

        注: 與溶劑對照組比較,aP<0.05。

        3 討論

        斑馬魚因與人基因同源高、樣本量大、具有體外受精和胚胎透明、易于養(yǎng)殖和活體觀察、方便控制實驗條件和檢測等獨特優(yōu)點,廣泛應用于疾病模型的建立和藥物篩選中[13]。關于斑馬魚在肝臟領域的研究報道逐漸增多,已經(jīng)建立了酒精性脂肪肝、藥物性肝損害和肝癌模型[14-17]。張云等[18]研究了不同濃度對乙酰氨基酚對肝臟熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚的肝臟毒性,經(jīng)對乙酰氨基酚處理后肝臟顏色變暗,卵黃囊腫,肝臟組織的 L-FABP 熒光表達下降,肝臟出現(xiàn)萎縮。 He等[19]用斑馬魚評價6種已知對人有肝毒性的藥物以及2種無肝毒性藥物的肝毒性,評價指標為:肝變性、肝腫大(萎縮)以及卵黃囊吸收延遲(意味著肝功能受到影響)。單盲法評價結果顯示,斑馬魚評價結果預測準確率為100%,組織病理學分析證實了斑馬魚表型觀察對藥物肝毒性預測的可靠性。目前,美國FDA和歐洲EMA已經(jīng)接受用斑馬魚肝毒性評價數(shù)據(jù)進行藥物臨床申報。

        本研究通過觀察不同濃度蘆薈大黃素(100~1000 μM)暴露后斑馬魚的一般情況,如生存率與表型等,發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的升高和處理時間的延長,斑馬魚生存率顯著下降,呈現(xiàn)明顯劑量反應關系。肝臟毒性評價指標顯示,蘆薈大黃素(76.3 μM、229 μM)未明顯改變斑馬魚的肝臟面積,但隨著蘆薈大黃素濃度增大,斑馬魚的肝臟不透光度增加及卵黃囊吸收延遲面積增大。蘆薈大黃素對斑馬魚CYP 3A4酶有顯著的抑制作用,呈現(xiàn)明顯劑量—反應關系。ELISA結果表明,蘆薈大黃素(76.3 μM、229 μM)能顯著上調(diào)Caspase9蛋白水平,引發(fā)級聯(lián)反應,導致Caspase3酶表達升高,誘導斑馬魚肝細胞凋亡。

        本實驗結果表明,蘆薈大黃素能誘導斑馬魚肝毒性發(fā)生,作用機制可能與蘆薈大黃素激活凋亡相關蛋白,誘導肝細胞凋亡,并且誘導斑馬魚Ⅰ相代謝酶的異常表達相關。

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