韓 飛，朱 祥，常 悅，董 倩，李俊凱

(長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 農(nóng)藥研究所，湖北 荊州 434025)

隨著大范圍推廣少耕、免耕栽培技術(shù)，種植油菜對(duì)除草劑的需求量呈逐年增加趨勢(shì)。乙草胺(Acetochlor)是適用于防除禾本科及部分闊葉雜草的酰胺類除草劑，具有藥效好、成本低廉的特點(diǎn)，是我國(guó)需求量最大的酰胺類除草劑之一[1]。然而，乙草胺對(duì)作物存在隱性藥害[2-3]，特別是用藥量過(guò)大或施藥后遇持續(xù)低溫高濕天氣，會(huì)嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量。截至目前，乙草胺的安全劑主要應(yīng)用在預(yù)防除草劑對(duì)單子葉作物產(chǎn)生藥害方面，而預(yù)防除草劑對(duì)雙子葉作物產(chǎn)生藥害仍然缺乏有效手段[4]。

內(nèi)生真菌印度梨形孢(Piriformosporaindica)是印度科學(xué)家VERMA等[5]在印度的塔爾沙漠中發(fā)現(xiàn)的，其作用與叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizal)真菌類似。因其可以促進(jìn)植株生長(zhǎng)和種子萌發(fā)，增加植物生物量、根系生物量及側(cè)根數(shù)[6-7]，還能提高植物對(duì)N、P、K的吸收[8]，增強(qiáng)植物抗旱[9]、抗鹽[10]、抗?jié)碀n[11]、抗病[12]等功能而備受關(guān)注，但是否能對(duì)作物藥害產(chǎn)生緩解作用，尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道[13]。以P.indica為供試材料，通過(guò)拌種處理，在盆栽試驗(yàn)條件下，探索P.indica緩解油菜乙草胺藥害的保護(hù)措施，并試圖探明P.indica緩解藥害的機(jī)制，旨在為油菜大田生產(chǎn)中乙草胺藥害的預(yù)防提供理論依據(jù)和借鑒措施，并為P.indica在田間的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 生物材料 蓉油14號(hào)油菜(BrassicanapusL.)種子購(gòu)自四川邡牌種業(yè)有限公司；P.indica由德國(guó)耶拿大學(xué)RALF Oelmüer教授惠贈(zèng)，用KM (Kaefe medium)固體培養(yǎng)基對(duì)P.indica進(jìn)行活化和增殖培養(yǎng)，黑暗條件下培養(yǎng)4 d[14]。

1.1.2 藥劑 50%乙草胺乳油購(gòu)自山東勝邦綠野化學(xué)有限公司；乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品發(fā)行中心；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)測(cè)定試劑盒、還原型谷胱甘肽(GSH)測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)分型測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；甲醇、石油醚、乙酸乙酯、無(wú)水硫酸鈉等均為分析純。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 FA2004電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司) 、紫外分光光度計(jì)UV3200S(上海美譜達(dá)儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 盆栽法測(cè)定P.indica對(duì)油菜生長(zhǎng)的影響 在塑料盆(16 cm×16 cm)中加入定量過(guò)篩的風(fēng)干土，并用一定量水將其浸濕，每1 kg油菜籽分別用5、10、20、50 gP.indica菌絲進(jìn)行拌種，并播于已裝土的塑料盆中。每盆25粒，每處理重復(fù)3次，覆蓋1 cm土，同時(shí)設(shè)未經(jīng)P.indica菌絲處理的種子為空白對(duì)照(CK1)，放于網(wǎng)室中。播后10 d測(cè)定株高、根長(zhǎng)以及單株鮮質(zhì)量，計(jì)算P.indica拌種對(duì)油菜的促長(zhǎng)率(P.indica拌種測(cè)定值，表示試驗(yàn)中用P.indica拌種后測(cè)量得到的油菜幼苗株高、根長(zhǎng)以及單株鮮質(zhì)量值；CK1測(cè)定值，表示試驗(yàn)中空白對(duì)照CK1測(cè)量得到的油菜幼苗株高、根長(zhǎng)以及單株鮮質(zhì)量值)。

促長(zhǎng)率=(P.indica拌種測(cè)定值-CK1測(cè)定值)/CK1測(cè)定值×100%

(1)

1.2.2 盆栽法測(cè)定P.indica緩解乙草胺對(duì)油菜的藥害 播前處理如1.2.1中所述，播后1 d用有效成分分別為0、400、800、1 200、2 400 g/hm2的乙草胺噴霧進(jìn)行土壤封閉，并設(shè)未經(jīng)P.indica菌絲及乙草胺處理的種子為空白對(duì)照(CK2)，播后10 d測(cè)定株高、根長(zhǎng)以及單株鮮質(zhì)量，并計(jì)算乙草胺對(duì)油菜的抑制率(CK2測(cè)定值，表示試驗(yàn)中空白對(duì)照CK2測(cè)量得到的油菜幼苗株高、根長(zhǎng)以及單株鮮質(zhì)量值；單施乙草胺測(cè)定值，表示試驗(yàn)中單獨(dú)施用乙草胺時(shí)油菜幼苗株高、根長(zhǎng)以及單株鮮質(zhì)量值)以及P.indica對(duì)油菜藥害的恢復(fù)率(P.indica拌種后施用乙草胺測(cè)定值，表示試驗(yàn)中經(jīng)P.indica拌種再施用乙草胺后測(cè)量得到的油菜幼苗株高、根長(zhǎng)以及單株鮮質(zhì)量值)。

抑制率=(CK2測(cè)定值-單施乙草胺測(cè)定值)/
CK2測(cè)定值×100%

(2)

恢復(fù)率=(P.indica拌種后施用乙草胺測(cè)定值-
單施乙草胺測(cè)定值)/CK2測(cè)定值×100%

(3)

1.2.3 GST、GSH及SOD的提取與測(cè)定 試驗(yàn)處理過(guò)程如1.2.2所述，經(jīng)不同拌種量(1 kg油菜籽添加5、10 g菌絲)拌種，再噴施不同有效成分的乙草胺(600、1 200、1 800 g/hm2),并設(shè)未經(jīng)P.indica菌絲及乙草胺處理的種子為空白對(duì)照(CK3)，于油菜播后10、15 d，取油菜幼苗的地上部分，并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行GST、GSH、SOD的提取與測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用SPSS 20.0進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 盆栽條件下P.indica對(duì)油菜的促生作用

由表1可知，與CK1對(duì)比，在拌種量為1 kg油菜籽添加50 gP.indica菌絲時(shí)，P.indica對(duì)油菜的株高、根長(zhǎng)、單株鮮質(zhì)量都有一定的抑制作用。而在1 kg油菜籽添加10 gP.indica菌絲時(shí)，P.indica對(duì)油菜的促生效果顯著，對(duì)株高、根長(zhǎng)、單株鮮質(zhì)量的促長(zhǎng)率分別為25.16%、31.36%、30.24%。

表1 P.indica拌種對(duì)油菜生長(zhǎng)的影響

注：同列不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。表中負(fù)值表示在該拌種濃度下P.indica對(duì)油菜生長(zhǎng)有一定的抑制作用。

Note:Different letters in the same column indicate significant different between different treatments (P<0.05),the same below.A negative value in the table indicates thatP.indicahas a certain inhibitory effect on the growth of rapeseed at the seed dressing concentration.

2.2 盆栽條件下P.indica緩解乙草胺對(duì)油菜藥害的效果

在盆栽條件下，與CK2對(duì)比，施用有效成分分別為400、800、1 200、2 400 g/hm2的乙草胺，均對(duì)油菜的株高、根長(zhǎng)、單株鮮質(zhì)量造成不同程度的影響。其中，對(duì)株高抑制率分別為29.12%、34.75%、48.66%、48.51%；對(duì)根長(zhǎng)抑制率分別為22.03%、27.54%、26.69%、27.12%；對(duì)單株鮮質(zhì)量抑制率分別為46.98%、53.02%、53.02%、79.87%。

用乙草胺進(jìn)行土壤封閉后，出芽的油菜會(huì)出現(xiàn)葉片卷曲、皺縮以及根系縮短、腫脹等現(xiàn)象，用P.indica菌絲進(jìn)行拌種的油菜在出芽后上述不良情況相對(duì)較輕。其中，1 kg油菜籽添加10 gP.indica菌絲時(shí)，對(duì)使用不同有效成分(400、800、1 200、2 400 g/hm2)的乙草胺藥害總體緩解效果最好，其生長(zhǎng)情況基本上與CK2持平，甚至優(yōu)于CK2。其中，對(duì)株高的藥害恢復(fù)率分別為30.79%、60.99%、26.99%、26.49%,對(duì)根長(zhǎng)的藥害恢復(fù)率分別為33.69%、21.51%、58.75%、31.67%,對(duì)單株鮮質(zhì)量的藥害恢復(fù)率分別為75.92%、45.50%、7.25%、33.33%。此外，1 kg油菜籽添加5 gP.indica菌絲的試驗(yàn)組，也對(duì)乙草胺藥害具有良好的緩解效果(表2)。

表2 P.indica拌種緩解乙草胺對(duì)油菜藥害的效果

續(xù)表2 P.indica拌種緩解乙草胺對(duì)油菜藥害的效果

2.3 盆栽條件下P.indica拌種對(duì)油菜幼苗GSH質(zhì)量濃度以及GST、SOD活性的影響

2.3.1P.indica拌種10 d后對(duì)油菜幼苗GSH質(zhì)量濃度以及GST、SOD活性的影響 如表3所示，經(jīng)P.indica菌絲單獨(dú)拌種10 d后，油菜幼苗的GSH質(zhì)量濃度以及GST、SOD活性與CK3相比，均有顯著提高。1 kg油菜籽添加5、10 g菌絲拌種后，在不施用乙草胺的情況下，GSH質(zhì)量濃度分別為0.33、0.31 g/L，高于對(duì)照組的0.25 g/L；GST活性分別為138.27、150.74 mol/(mg·min)，高于對(duì)照組的117.53 mol/(mg·min)；SOD活性分別為38.64、33.85 U/g，高于對(duì)照組的23.88 U/g。

經(jīng)不同拌種量(1 kg油菜籽添加5、10 g菌絲)拌種后，再噴施不同有效成分的乙草胺(600、1 200、1 800 g/hm2)，油菜中的相關(guān)解毒酶的活性及質(zhì)量濃度均有增加。2組不同拌種量的處理組(1 kg油菜種子添加5、10 g菌絲)，其對(duì)油菜的酶活性及質(zhì)量濃度的影響整體相當(dāng)。

表3 P.indica拌種對(duì)油菜幼苗GSH質(zhì)量濃度以及GST、SOD活性的影響(10 d后)Tab.3 Effect of P.indica seed dressing on GSH mass content,GST and SOD activities of rape seedlings (after 10 d)

2.3.2P.indica拌種15 d后對(duì)油菜幼苗GSH質(zhì)量濃度以及GST、SOD活性的影響 由表4可知，15 d后，空白對(duì)照(CK3)中的GSH質(zhì)量濃度、GST及SOD活性有明顯提高，經(jīng)P.indica菌絲單獨(dú)拌種后，油菜幼苗中的相關(guān)解毒酶的活性及質(zhì)量濃度依然高于CK3，單獨(dú)使用乙草胺的油菜其相關(guān)酶質(zhì)量濃度及活性總體略高于CK3。

經(jīng)P.indica菌絲拌種的油菜種子，再噴施有效成分分別為600、1 200、1 800 g/hm2的乙草胺，油菜中的相關(guān)解毒酶的活性及質(zhì)量濃度均高于單獨(dú)使用乙草胺的處理組，也高于CK3。以乙草胺濃度為600 g/hm2為例，1 kg油菜籽用5 g菌絲拌種試驗(yàn)組的GSH質(zhì)量濃度為0.58 g/L，GST、SOD的活性分別為181.41 mol/(mg·min)、54.70 U/g；1 kg油菜籽用10 g菌絲拌種試驗(yàn)組的GSH質(zhì)量濃度為0.60 g/L，GST、SOD的活性分別為203.94 mol/(mg·min)、59.34 U/g,均高于單用乙草胺時(shí)GSH的質(zhì)量濃度(0.41 g/L)及GST、SOD的活性[146.48 mol/(mg·min)、46.86 U)]。

表4 P.indica拌種對(duì)油菜幼苗GSH質(zhì)量濃度以及GST、SOD活性的影響(15 d后)Tab.4 Effect of P.indica seed dressing on GSH mass content and GST and SOD activities of rape seedlings(after 15 d)

3 結(jié)論與討論

植物中的SOD、GSH是具有特殊功能的多肽，其主要功能是清除在逆境環(huán)境下植物體內(nèi)積累的過(guò)量活性氧，在植物脫毒和維持氧化還原緩沖液中起重要作用。相對(duì)于SOD，GSH自身并不能起到脫毒作用，必須在GST催化下，才能與有毒物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為無(wú)害或低毒物質(zhì)[15-16]。根據(jù)目前研究結(jié)果，酰胺類除草劑安全劑的作用機(jī)制主要為結(jié)構(gòu)活性(QSAR)機(jī)理論[17]、谷胱甘肽軛合作用機(jī)理論[18]以及植物細(xì)胞色素P450催化代謝論[19]，而乙草胺通常在植物體內(nèi)的主要解毒機(jī)制是谷胱甘肽軛合作用，其通過(guò)在GST催化下迅速與GSH進(jìn)行軛合反應(yīng)，使乙草胺對(duì)植物喪失生理毒性[20-21]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)乙草胺有效成分施用量為400、800、1 200、2 400 g/hm2時(shí)，用50 gP.indica菌絲拌種1 kg油菜籽時(shí)，均對(duì)油菜的藥害恢復(fù)具有良好效果。同時(shí)乙草胺還能對(duì)油菜幼苗的GSH質(zhì)量濃度、GST及SOD活性具有一定的刺激作用，適量P.indica拌種可以通過(guò)提高油菜相關(guān)解毒酶的活性及質(zhì)量濃度，加強(qiáng)油菜自身對(duì)乙草胺的代謝，從而緩解乙草胺藥害對(duì)油菜的影響，這也是首次對(duì)P.indica緩解作物藥害方面進(jìn)行報(bào)道。P.indica菌絲濃度較高(50 gP.indica菌絲拌種1 kg油菜籽)時(shí)，油菜幼苗在相關(guān)生長(zhǎng)指標(biāo)上均表現(xiàn)了一定的抑制作用，這也與陳佑源[22]的研究結(jié)果一致，但在噴施乙草胺后，對(duì)乙草胺藥害也有一定的緩解作用。根據(jù)DESHMUKH等[23]的研究，P.indica在接種轉(zhuǎn)基因大麥時(shí)，用熒光標(biāo)記的BI-1基因(普遍存在于真核細(xì)胞中，控制細(xì)胞程序性死亡，阻止細(xì)胞死亡)高度表達(dá)，P.indica的定殖與繁殖受到強(qiáng)烈抑制，表明P.indica在定殖過(guò)程需要寄主細(xì)胞死亡。因此，油菜在生長(zhǎng)初期出現(xiàn)上述情況，推測(cè)是由于P.indica的定殖與繁殖同油菜幼苗爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)而引起的。同時(shí)在試驗(yàn)中，5 gP.indica菌絲拌種與10 g菌絲拌種的試驗(yàn)組其酶活性及質(zhì)量濃度雖然接近，但在油菜幼苗的生理指標(biāo)上，后者相對(duì)占優(yōu)勢(shì)。綜上所述，P.indica對(duì)油菜苗期的乙草胺藥害具有較好的緩解效果，這也為P.indica菌肥在作物上更好的運(yùn)用提供了新的研究思路。