譚玉文，饒友生，劉慧琳，肖月玲,2，徐 霞,3，陳 穎，朱學(xué)農(nóng)

(1.南昌師范學(xué)院 生物技術(shù)研究所/江西省地方雞種遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330032；2.城南中學(xué)，江西 永新 343400； 3.江西省南城縣第一中學(xué)，江西 撫州 344700)

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)是指DNA序列上單個核苷酸的變化，其核苷酸變異主要是由堿基的顛換、轉(zhuǎn)換、插入或缺失所引起的[1]。SNP由于其分布廣、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、密度高且易于自動化檢測等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是第3代分子遺傳標(biāo)記。SNP不僅運(yùn)用于尋找人類遺傳病相關(guān)基因的突變位點(diǎn)，而且在構(gòu)建家禽遺傳連鎖圖譜和遺傳育種中也被廣泛應(yīng)用[2]。同時SNP可能對發(fā)生在編碼區(qū)的基因的功能特性產(chǎn)生影響，對家禽的生產(chǎn)性能、肉質(zhì)、抗病性能進(jìn)行數(shù)量性狀基因座(QTL)分析具有重要意義[3-4]。

寧都黃雞、白耳黃雞和安義瓦灰雞都是江西省優(yōu)質(zhì)地方雞種，有著優(yōu)異的生產(chǎn)性能和營養(yǎng)價值。近年來，江西省為這3個雞種種質(zhì)資源保護(hù)投入了大量的人力與物力。以寧都黃雞、白耳黃雞和安義瓦灰雞3個品種為研究對象，在雞1號染色體的Contig.060226.1上500 kb區(qū)域選取25個SNP位點(diǎn)進(jìn)行飛行質(zhì)譜分型，并進(jìn)行遺傳多樣性比較及遺傳距離的分析，以揭示3個地方雞種的遺傳特征，為江西省地方雞品種資源開發(fā)和種質(zhì)資源保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試動物

寧都黃雞(155只)來自江西贛州寧都黃雞保種場，白耳黃雞(150只)來自江西上饒廣豐白耳黃雞保種場，安義瓦灰雞(158只)來自江西南昌安義瓦灰雞保種場。

1.2 血液采集及DNA提取

用一次性注射器從雞翅靜脈中抽取約1 mL血液，注入經(jīng)高壓滅菌后并裝有35 μL 2% EDTA抗凝劑的離心管內(nèi)，搖勻并編號，-20 ℃保存。用NRBC Blood DNA提取試劑盒(OMEGA公司)提取供試雞血液的總DNA，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Nanodrop 2000檢測DNA含量，稀釋成終質(zhì)量濃度為100 ng/μL，-20 ℃保存，用于后續(xù)的飛行質(zhì)譜分型分析。

1.3 飛行質(zhì)譜分型

采用Sequenom Mass Array系統(tǒng)(北京華諾時代科技有限公司)對已選定的25 個SNP 位點(diǎn)在寧都黃雞、白耳黃雞、安義瓦灰雞3個群體中進(jìn)行基因型分型?；蛐头中偷木唧w步驟如下：①以各SNP 位點(diǎn)為中心在其前后截取100 bp以上長度的DNA 序列，利用Assay Designer設(shè)計(jì)各位點(diǎn)相應(yīng)的引物；②以提取的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對PCR產(chǎn)物堿性磷酸酶處理后進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)；③將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到Spectro芯片上，用飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)進(jìn)行分析[5]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

檢測結(jié)果使用TYPER 4.0軟件分型，利用Microsatellite Toolkit軟件計(jì)算有效等位基因數(shù)(Ne)、表觀雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)。用Popgene 32軟件進(jìn)行群體Nei氏遺傳距離、相似性分析及聚類分析，并對各位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3個雞群體遺傳多樣性的比較

由表1可知，25個SNP在3個雞群體中的平均有效等位基因數(shù)、期望雜合度和多態(tài)信息含量分別為1.636、0.367和0.291，其中白耳黃雞的平均有效等位基因數(shù)、期望雜合度和多態(tài)信息含量最高(1.684、0.387和0.303)；安義瓦灰雞最低(1.562、0.328和0.262)；寧都黃雞平均值介于白耳黃雞和安義瓦灰雞之間(1.662、0.386和0.302)。寧都黃雞和安義瓦灰雞表觀雜合度均為0.271，白耳黃雞的表觀雜合度最高為0.290。

表1 3個雞群體中25個SNP位點(diǎn)的遺傳參數(shù)Tab.1 Genetic parameters of 25 SNPs in three chicken populations

續(xù)表1 3個雞群體中25個SNP位點(diǎn)的遺傳參數(shù)Tab.1(Continued) Genetic parameters of 25 SNPs in three chicken populations

2.2 3個雞群體遺傳距離和聚類分析

用Popgene 32軟件對3個雞群體間的Nei氏相似性系數(shù)和遺傳距離進(jìn)行分析，同時根據(jù)遺傳距離，采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。白耳黃雞和安義瓦灰雞的相似性最高，為0.963 4，寧都黃雞與白耳黃雞相似性為0.952 6，寧都黃雞與安義瓦灰雞相似性最低為0.931 0(表2)；聚類分析顯示，安義瓦灰雞與白耳黃雞聚為一類，寧都黃雞單獨(dú)聚為一類(圖1)。

表2 3個雞群體間的Nei氏遺傳相似性系數(shù)(右上)和遺傳距離(左下)Tab.2 Nei’s genetic similarity coefficient(upper right) and genetic distance(lower left) in three chicken populations

2.3 3個雞群體的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

由表3可知，寧都黃雞中有10個SNP位點(diǎn)不符合遺傳平衡法則，白耳黃雞中有16個SNP位點(diǎn)不符合遺傳平衡法則，安義瓦灰雞中有11個SNP位點(diǎn)不符合遺傳平衡法則，3個雞群體部分位點(diǎn)偏離的這種現(xiàn)象可能是各保種場對雞群進(jìn)行人工選育的結(jié)果。

圖1 3個雞群體基于Nei氏遺傳距離的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA clustering map based on Nei’s genetic distance in three local breeds

3 結(jié)論與討論

遺傳多樣性的檢測能有效地指導(dǎo)育種方案的制定和工作成果的檢驗(yàn)，其中雜合度、等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量是評價遺傳多樣性3個重要的參數(shù)[6]。在本研究中，寧都黃雞、白耳黃雞和安義瓦灰雞在25個位點(diǎn)的平均期望雜合度分別為0.386、0.387、0.328，且平均表觀雜合度低于平均期望雜合度，可能是不同群體由于地域隔離經(jīng)歷了一定程度的近交或自交，引起雜合子缺失，純合子比例較高[7]，或者是出現(xiàn)了基因突變或者隨機(jī)性的基因漂移導(dǎo)致這種情況[8]。多態(tài)信息含量是評估群體遺傳多樣性和衡量等位基因片段多態(tài)性的理想指標(biāo)。當(dāng)PIC>0.50時，表示具有高度多態(tài)性；當(dāng)0.25

表3 3個雞群體25個SNP位點(diǎn)的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)Tab.3 Hardy-Weinberg equilibrium test of 25 SNPs loci in three breeds

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

Note: * indicates that the difference is significant (P<0.05), ** indicates that the difference is extremely significant (P<0.01).

遺傳距離是指不同的種群或種間的基因差異的程度，估算群體間的遺傳距離是探究物種起源、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹、分析群體間親緣關(guān)系的基礎(chǔ)[12]，并對育種中指導(dǎo)親本選配有著積極的作用。本研究中，3個品種的遺傳相似性指數(shù)都大于90%，說明這3個品種的親緣關(guān)系都比較近，聚類分析結(jié)果顯示，安義瓦灰雞與白耳黃雞聚為一類，寧都黃雞單獨(dú)聚為一類，這個結(jié)果也與陳寬維等[10]的聚類結(jié)果相一致。Hardy-Weinberg平衡的檢驗(yàn)結(jié)果顯示部分位點(diǎn)處于不平衡的狀態(tài)，這與張德寧等[13]對黃選1號三疣梭子蟹生長性狀SNP的研究結(jié)果相類似。偏離Hardy-Weinberg平衡的位點(diǎn)可能是人工選育、遺傳漂變等因素所致，3個雞群都是經(jīng)過多代人工選育的種群，這樣可能會引起雜合子丟失，導(dǎo)致部分等位基因的頻率發(fā)生改變。