張亞楠，徐景峨，蒲 齡，彭 珊，田青青，楊 莉，王 鑫，姜玲玲，余 波

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550005； 2.貴州師范學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000)

鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌是引起水禽細(xì)菌性疾病的常見(jiàn)致病菌[1-4]。由于致病菌往往具有較多的血清型，且各血清型間無(wú)明顯的交叉保護(hù)現(xiàn)象，導(dǎo)致疫苗在預(yù)防細(xì)菌性疾病上效果欠佳[1,5-6]?？咕幬镏委熓强刂萍?xì)菌病的常用方法，同時(shí)也是控制細(xì)菌病流行性暴發(fā)的重要途徑。但是，由于細(xì)菌病發(fā)病時(shí)間不固定、頻率高，養(yǎng)殖場(chǎng)往往擅自使用高濃度抗菌藥物進(jìn)行預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性和抗菌藥物殘留，給養(yǎng)殖業(yè)和人類健康帶來(lái)危害[7-8]。

目前，中藥制劑作為抗生素替代品的研發(fā)成為研究熱點(diǎn)。中藥制劑具有廣譜抗菌抗病毒、提高機(jī)體免疫力、不易產(chǎn)生耐藥性、殘留小等方面的特點(diǎn)[9-10]。中藥五倍子及單體沒(méi)食子酸(即五倍子酸)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌均有較好的抑制作用[10-11]。鞣花酸對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌有較好的抑制作用[12]，秦皮乙素對(duì)產(chǎn)KPC型碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌具有一定的抑制作用[13]。鑒于此，將石榴皮、苦參、秦皮配伍使用，經(jīng)提取和噴霧干燥制得的中藥復(fù)方制劑石苦秦散，對(duì)豬源大腸桿菌具有較好的抑菌效果，MIC和MBC分別介于7.81～15.63 g/L和15.63～31.25 g/L[9]。但是，中藥制劑對(duì)水禽源多重耐藥菌株的抑菌效果及殺菌效果研究相對(duì)較少。為此，探究石苦秦散及其6種主要活性成分(苦參堿、氧化苦參堿、秦皮甲素、秦皮乙素、鞣花酸、沒(méi)食子酸)單體對(duì)引起水禽疾病的常見(jiàn)菌種(鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌)的抑菌作用，綜合評(píng)價(jià)中藥復(fù)方制劑石苦秦散對(duì)水禽源細(xì)菌病治療效果，為石苦秦散治療畜禽常見(jiàn)細(xì)菌性疾病提供理論依據(jù)，以期為“減抗化”生態(tài)養(yǎng)殖的發(fā)展提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 大腸桿菌ATCC?25922標(biāo)準(zhǔn)株、沙門氏菌ATCC?13076標(biāo)準(zhǔn)株、金黃色葡萄球菌ATCC?6538標(biāo)準(zhǔn)株均由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所獸用中草藥研究室保存。5株鴨疫里氏桿菌、5株鴨源大腸桿菌、2株鴨源多殺性巴氏桿菌、2株鴨源沙門氏菌均由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病研究室分離保存。菌株具體信息見(jiàn)表1。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 21種細(xì)菌藥敏紙片均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。二甲基亞砜(DMSO)、無(wú)水乙醇、甲醇等購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠。秦皮甲素、秦皮乙素、沒(méi)食子酸、鞣花酸、苦參堿、氧化苦參堿均購(gòu)自西安開來(lái)生物工程有限公司。石苦秦散(包裝規(guī)格：100 g/袋；由石榴皮、苦參、秦皮經(jīng)水提后噴霧干燥制得， 批號(hào)：20180520)由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、 成都乾坤動(dòng)物藥業(yè)有限公司合作提供。

水解酪蛋白肉湯(MH broth)、水解酪蛋白瓊脂(MH agar)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(XLD)、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基(CHRO magarSalmonellaagar)、麥康凱瓊脂(Mac conkey agar)、甘露醇瓊脂、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(Tryptic soy agar，TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptic soy broth，TSB)等均購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。酵母提取粉(Yeast extract)購(gòu)自英國(guó)OXOID公司。新生牛血清購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥液制備 將每種中藥單體及石苦秦散復(fù)方制劑用相應(yīng)的溶劑溶解，再加滅菌超純水定容，配制成一定質(zhì)量濃度的母液，滅菌后置 4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。藥物配制所用溶劑和稀釋劑?jiàn)表2。

表1 14株鴨源分離株的信息Tab.1 Information of 14 isolates from duck farms

表2 石苦秦散及其主要活性成分單體的配制Tab.2 The preparation of Shikuqin powder and its main active component monomers

1.2.2 菌液制備 將大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌接種于含MH液體培養(yǎng)基的試管中，置于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h。將多殺性巴氏桿菌接種于含MH液體培養(yǎng)基(含5%血清)的試管中，置于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)18 h。將鴨疫里氏桿菌接種于含TSB液體培養(yǎng)基(含0.5%酵母提取物、5%血清)的試管中，置于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)18 h。分別用其相應(yīng)的液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液的OD600為 0.8，再用培養(yǎng)基稀釋1 000倍，相當(dāng)于菌液濃度為105～106cfu/mL，備用。

1.2.3 耐藥表型的測(cè)定 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)的指導(dǎo)原則，采用藥敏紙片法檢測(cè)本研究中所用的3株標(biāo)準(zhǔn)株和14株分離株對(duì)21種抗菌藥物的敏感性。其中，以大腸桿菌ATCC?25922作為質(zhì)控菌株。大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌所用培養(yǎng)基為MH瓊脂平板；多殺性巴氏桿菌所用培養(yǎng)基為加5%新生牛血清的MH瓊脂平板；鴨疫里氏桿菌所用培養(yǎng)基為加5%新生牛血清的TSA瓊脂平板。

由于缺少CLSI批準(zhǔn)的適合鴨疫里氏桿菌的藥物敏感折點(diǎn)值，受試藥物的質(zhì)控范圍及敏感折點(diǎn)值判斷標(biāo)準(zhǔn)主要參考CLSI動(dòng)物源細(xì)菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和人醫(yī)CLSI細(xì)菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的適用于大腸桿菌的判定標(biāo)準(zhǔn)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果參考CLSI規(guī)定的敏感(Susceptible，S)、中介(Intermediate，I)、耐藥(Resistance，R)折點(diǎn)值范圍判斷結(jié)果。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 采用微量肉湯二倍稀釋法，于無(wú)菌96孔板每一孔中均加入100 μL肉湯，再分別向第一孔中加入100 μL配備好的藥液，混勻后依次倍比稀釋，直到最后一孔混勻后棄去100 μL混合液。每孔加入配備好的100 μL細(xì)菌稀釋液。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組(加菌不加藥)和陰性對(duì)照組(不加菌不加藥)。此外，在正式試驗(yàn)之前還需設(shè)置有機(jī)溶劑對(duì)照組，即對(duì)每株菌進(jìn)行有機(jī)溶劑的對(duì)照試驗(yàn)，將藥液換成有機(jī)溶劑(甲醇、乙醇和DMSO)，從而測(cè)定能保證所有供試菌株存活的最大溶劑含量，以便制備藥液所用的溶劑含量遠(yuǎn)低于此值。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后取出，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。每組試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

采用TTC法對(duì)MIC結(jié)果進(jìn)行判定。向上述培養(yǎng)24 h后的96孔板每孔分別加入20 μL 0.5%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，37 ℃避光培養(yǎng)2 h，觀察菌液的顏色變化。試驗(yàn)組眼觀溶液澄清、顏色未發(fā)生變化的最低藥物質(zhì)量濃度則作為該藥的MIC。

1.2.5 最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 將上述試驗(yàn)組澄清的各孔中液體取100 μL涂布于相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果。以肉眼觀察無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低藥物質(zhì)量濃度為其MBC。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床分離株耐藥表型

以大腸桿菌ATCC?25922作為質(zhì)控菌株，選用的藥敏紙片均在質(zhì)控范圍內(nèi)。沙門氏菌ATCC?13076除對(duì)林可胺類抗生素克林霉素耐藥外，對(duì)其余20種藥均敏感；金黃色葡萄球菌ATCC?6538對(duì)所選用的21種藥物均敏感，沙門氏菌ATCC?13076和金黃色葡萄球菌ATCC?6538作為敏感對(duì)照組。檢測(cè)到14株臨床分離株除PmSS5外，其余均為多重耐藥株。腸桿菌屬的大腸桿菌和沙門氏菌分離株耐藥性較強(qiáng)，耐藥種數(shù)最多，均高于8種，其中ECSS7耐藥種數(shù)高達(dá)13種；其次是鴨疫里氏桿菌，耐藥種數(shù)介于5～8種，主要是對(duì)氨基糖苷類耐藥嚴(yán)重。2株水禽源多殺性巴氏桿菌較為敏感，PmSS5僅對(duì)克林霉素和人工合成的抗菌藥磺胺異惡唑耐藥?？肆置顾剡m用于革蘭氏陽(yáng)性菌引起的各種感染性疾病，對(duì)革蘭氏陰性菌作用效果差，通常用于治療厭氧細(xì)菌以及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的感染?；前奉愃幬餅楸容^老的人工合成抗菌藥物，14株分離株均對(duì)其耐藥(表3、4)。

表3 14株分離株對(duì)21種抗菌藥物的耐藥情況Tab.3 Resistance of 14 isolates to 21 antibiotics

續(xù)表3 14株分離株對(duì)21種抗菌藥物的耐藥情況Tab.3(Continued) Resistance of 14 isolates to 21 antibiotics

注:S為敏感，I為中介，R為耐藥。

Note:S is susceptible,I is intermediate and R is resistance.

表4 14株分離株的耐藥表型及耐藥種數(shù)Tab.4 Resistant phenotype and Resistant species of 14 isolates

2.2 石苦秦散及6種主要活性成分單體的抑菌作用

由表5可知，石苦秦散及6種單體對(duì)17株細(xì)菌均有抑菌作用。石苦秦散對(duì)17株細(xì)菌的MIC介于1.95～62.50 g/L；其中，對(duì)鴨疫里氏桿菌和多殺性巴氏桿菌的MIC介于1.95～15.63 g/L；對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌的抑菌效果相對(duì)弱一些，MIC介于15.63～62.50 g/L。

由圖1可看出， 6種單體抑菌能力最強(qiáng)的為秦皮乙素，其次為苦參堿、沒(méi)食子酸?？鄥A除對(duì)金黃色葡萄球菌6538的MIC(15.63 g/L)較高外，其余均低于7.81 g/L。氧化苦參堿除對(duì)鴨疫里氏桿菌的MIC相對(duì)較低，介于3.91～15.63 g/L，對(duì)其余4種細(xì)菌的MIC均大于31.25 g/L?？梢?jiàn)，氧化苦參堿的抑菌作用明顯弱于苦參堿。秦皮甲素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌的MIC高于另外4種革蘭氏陰性菌，且對(duì)鴨疫里氏桿菌的抑菌作用最強(qiáng)，MIC介于3.91～7.81 g/L。秦皮乙素對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌效果也強(qiáng)于革蘭氏陽(yáng)性菌，且對(duì)4種革蘭氏陰性菌的MIC均小于1.95 g/L。沒(méi)食子酸對(duì)鴨疫里氏桿菌和多殺性巴氏桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果，對(duì)鴨疫里氏桿菌的MIC介于0.03～0.98 g/L，對(duì)多殺性巴氏桿菌的MIC為1.95 g/L。鞣花酸對(duì)不同種屬菌株的抑菌作用存在較大差異，對(duì)鴨疫里氏桿菌的抑菌效果最好，MIC介于0.49～1.95 g/L；鞣花酸對(duì)同種菌屬的不同細(xì)菌也存在差異，如大腸桿菌25922、ECSS7的MIC分別為0.98 g/L和0.49 g/L，而其他4株大腸桿菌的MIC均高于31.25 g/L。

大腸桿菌ATCC?25922標(biāo)準(zhǔn)株為敏感株，但和其他多重耐藥大腸桿菌相比MIC區(qū)別不大，說(shuō)明石苦秦散及6種單體的抑菌作用與菌株的敏感程度無(wú)關(guān)。沙門氏菌ATCC?13076、金黃色葡萄球菌ATCC?6538、多殺性巴氏桿菌分離株P(guān)mSS5均為敏感株，和其他耐藥菌株相比未表現(xiàn)出較低的MIC。

2.3 石苦秦散及其6種主要活性成分單體的殺菌作用

由表5可知，石苦秦散及其6種單體對(duì)17株細(xì)菌均有殺菌效果。石苦秦散對(duì)17株菌的MBC介于1.95～125.00 g/L。6種單體體外殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到31.25 g/L時(shí)，沒(méi)食子酸能殺死所有供試菌株，整體殺菌效果優(yōu)于其他5種單體(圖2)。氧化苦參堿、鞣花酸、秦皮甲素、秦皮乙素4種單體對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌殺菌效果相對(duì)弱一些，MBC為125.00 g/L。秦皮乙素、沒(méi)食子酸對(duì)多殺性巴氏桿菌的MBC和MIC相等，分別為0.12 g/L和1.95 g/L，說(shuō)明這2種中藥單體對(duì)多殺性巴氏桿菌的抑菌效果和殺菌效果相同。石苦秦散復(fù)方制劑和6種中藥單體對(duì)5株鴨疫里氏桿菌的MBC和MIC均相差不大，且均低于其他菌株，說(shuō)明這些中藥對(duì)鴨疫里氏桿菌的抑菌效果和殺菌效果相對(duì)較好。

表5 石苦秦散及其6種主要活性成分單體的抑菌/殺菌效果

圖1 石苦秦散及6種有效成分單體對(duì)17株細(xì)菌的MIC分布

圖2 石苦秦散及6種有效成分單體對(duì)17株細(xì)菌的MBC分布

3 結(jié)論與討論

目前，治療水禽細(xì)菌性疾病主要是使用抗生素，然而不合理的使用加劇了多重耐藥菌株的出現(xiàn)[14-15]。本研究所用的14株分離株，90%為多重耐藥菌株，腸桿菌屬的大腸桿菌和沙門氏菌分離株最為耐藥，耐藥種數(shù)最多，均高于8種，其中大腸桿菌ECSS7耐藥種數(shù)高達(dá)13種，鴨疫里氏桿菌的耐藥種數(shù)介于5～8種，可見(jiàn)水禽源細(xì)菌耐藥性普遍嚴(yán)重，為水禽源細(xì)菌病的治療帶來(lái)很大難題。當(dāng)前我國(guó)正在實(shí)施退出行動(dòng)、減抗行動(dòng)。減抗初期會(huì)導(dǎo)致治療抗菌藥用量增加、養(yǎng)殖生產(chǎn)性能下降以及食品動(dòng)物感染性疾病發(fā)病率增加[16]，如何安全度過(guò)減抗期，發(fā)揮我國(guó)傳統(tǒng)中藥的優(yōu)勢(shì)，尋找新的抗生素替代物且不產(chǎn)生耐藥成為防治細(xì)菌性疾病的新途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方制劑石苦秦散對(duì)鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌作用和殺菌作用，MIC介于1.95～62.50 g/L，MBC介于1.95～125.00 g/L。YU等[9]報(bào)道的石苦秦散對(duì)仔豬腹瀉型大腸桿菌的MIC與MBC分別為7.81～15.63 g/L、15.63～31.25 g/L，與本研究中，石苦秦散對(duì)多重耐藥的大腸桿菌的MIC和MBC較為接近，說(shuō)明石苦秦散對(duì)大腸桿菌普遍具有良好的抗菌效果。此外，石苦秦散對(duì)鴨疫里氏桿菌抑菌效果和殺菌效果明顯優(yōu)于其他菌株，MIC與MBC較低，且均介于1.95～15.63 g/L，在臨床上具有很高的應(yīng)用價(jià)值[17]。由于鴨疫里氏桿菌極易產(chǎn)生耐藥性，尋求新的、安全可靠的治療方法是必要的。

6種中藥單體中，抑菌能力最強(qiáng)的為秦皮乙素，除對(duì)金黃色葡萄球菌6538的MIC較高(15.63 g/L)，對(duì)其余16株菌的MIC介于0.03～1.95 g/L。但是，秦皮乙素的殺菌效果因菌種不同而存在差異，其對(duì)鴨疫里氏桿菌和多殺性巴氏桿菌的殺菌效果較好，MBC介于0.03～0.49 g/L；而對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的MBC均高于62.50 g/L。值得注意的是，秦皮甲素和秦皮乙素對(duì)大腸桿菌都具有較好抑菌作用，MIC分別為15.63 g/L和0.49～0.98 g/L，這和DUNCAN等[18]報(bào)道的秦皮甲素和秦皮乙素能夠減少動(dòng)物腸道中大腸桿菌數(shù)量相符。但是秦皮甲素和秦皮乙素對(duì)大腸桿菌的MBC分別為125.00 g/L和62.50～125.00 g/L，說(shuō)明殺菌效果欠佳，這可能與大腸桿菌某些血清型有一定的關(guān)系。在6種中藥單體殺菌效果試驗(yàn)中，對(duì)5種供試菌殺菌效果最好的為沒(méi)食子酸，當(dāng)濃度達(dá)到31.25 g/L時(shí)，沒(méi)食子酸能殺死所有供試菌株，整體殺菌效果優(yōu)于其他5種單體。其中，沒(méi)食子酸對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為7.81 g/L和31.25 g/L，這與LIU等[19]的報(bào)道相符。

本研究中，中藥單體秦皮乙素、沒(méi)食子酸以及鞣花酸對(duì)鴨疫里氏桿菌均表現(xiàn)出良好的抑菌效果和殺菌效果，MIC為0.03～0.12 g/L、0.03～0.98 g/L和0.49～1.95 g/L，MBC與MIC相差不大，這些中藥單體為開發(fā)治療傳染性漿膜炎藥品提供了一個(gè)新的思路。鴨疫里氏桿菌本身具有產(chǎn)膜能力，而沒(méi)食子酸通過(guò)抑制細(xì)菌生物膜主要成分多糖的合成來(lái)抑制其形成，從而起到殺菌的效果[20]。同時(shí)，中藥單體秦皮乙素、沒(méi)食子酸對(duì)多殺性巴氏桿菌的MBC和MIC相同且較低，分別為0.12 g/L和1.95 g/L，在臨床上具有一定的使用價(jià)值，也為禽霍亂的治療提供了新的思路。

此外，本研究還表明，石苦秦散復(fù)方制劑和6種中藥單體的抑菌作用或殺菌作用，均與菌株對(duì)抗生素的敏感程度無(wú)關(guān)，這對(duì)中藥制劑控制細(xì)菌耐藥性提供了可能。