尹寶穎，馬 宏，李中勇，龐錦軒，賈秋蕊，張學(xué)英，徐繼忠

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071000； 2.保定市農(nóng)業(yè)生態(tài)園管理處，河北 保定 071000；3.遷西縣林業(yè)局，河北 遷西 064300)

桃果外表色澤艷麗，營養(yǎng)豐富，口感細(xì)膩，深受消費(fèi)者喜愛。設(shè)施桃栽培可以實(shí)現(xiàn)桃果提前上市，滿足市場需求，因此桃已成為目前設(shè)施果樹栽培的主要樹種[1]，但由于設(shè)施內(nèi)環(huán)境與露地環(huán)境存在差異，設(shè)施內(nèi)栽培的桃樹果實(shí)普遍存在口感不佳、低糖高酸的現(xiàn)象[2]。有機(jī)酸是果實(shí)中酸的主要成分，果實(shí)中不同的有機(jī)酸種類、含量和比例是決定果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的重要基礎(chǔ)[3]。有關(guān)果實(shí)中有機(jī)酸含量、組分及其相關(guān)酶活性變化已在蘋果、梨、杏、李、藍(lán)莓、棗、葡萄等樹種上有研究報(bào)道[4-9]。趙永紅等[10]認(rèn)為，設(shè)施油桃果實(shí)中有機(jī)酸組分主要為蘋果酸和檸檬酸，隨著果實(shí)生長發(fā)育，蘋果酸含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，檸檬酸含量呈平穩(wěn)上升的趨勢。但有關(guān)設(shè)施內(nèi)外有機(jī)酸含量差異報(bào)道較少。果實(shí)中有機(jī)酸含量的變化與相關(guān)酶活性的變化關(guān)系密切，已有相關(guān)研究表明，影響果實(shí)有機(jī)酸含量變化的主要酶包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、蘋果酸酶(ME)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、檸檬酸合成酶(CS)、異檸檬酸脫氫酶(IDH)和烏頭酸酶(ACO)[11-12]。前人認(rèn)為有機(jī)酸類型不同的果實(shí)中有機(jī)酸合成酶和代謝酶的活性存在很大差異[13]。本研究分析設(shè)施內(nèi)外春美桃果實(shí)不同時(shí)期的有機(jī)酸含量、組分以及相關(guān)酶的活性變化，為改善設(shè)施內(nèi)春美桃果實(shí)品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選取自河北省順平縣桃樹栽培基地，該基地主栽品種為春美桃，露地樹齡為5 a，樹形為三主枝開心形，株行距為1.5 m×3.0 m，試驗(yàn)園整體管理水平高；選取長勢一致、生長健壯的樹為試驗(yàn)樹。設(shè)施內(nèi)桃樹樹齡為5 a，樹形為紡錘形，株行距為1.0 m×2.0 m，試驗(yàn)園整體管理水平高。于盛花后第5周開始，每周取樣1次，在每棵樹外圍中上部的4個(gè)方向各采果1個(gè)，共采集5棵樹，采后將果肉立即放入液氮冷凍，然后保存于-80 ℃的超低溫冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 可滴定酸含量的測定 采用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定法[14]測定可滴定酸含量。

1.2.2 有機(jī)酸含量的測定 先將桃果實(shí)去皮去核取果肉，準(zhǔn)確稱取3 g果肉，放入研缽，研磨至勻漿轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，加入超純水至刻度，放入超聲振蕩清洗機(jī)中超聲30 min，然后放入離心機(jī)中，在10 000 r/min、4 ℃下離心30 min，取出上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾到1.5 mL進(jìn)樣小瓶中，上機(jī)測定。

采用液相色譜法測定。色譜儀為Agilent 1260 高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，帶紫外檢測器。測定條件：Hypersil ODS2色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為KH2PO4(0.02 mol/L，pH值2.4)，流速0.8 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長210 nm。

1.2.3 相關(guān)酶活性的測定

1.2.3.1 酶液的制備 參考HIRAI[15]和李雪梅[16]的方法，略有改動(dòng)。取3 g果肉用3 mL研磨液在冰浴下研磨，4 000 r/min離心20 min，取上清液定容至5 mL，其中2 mL于4 ℃、15 000 r/min離心15 min，取上清液用提取緩沖液定容至4 mL，即得細(xì)胞質(zhì)烏頭酸酶(Cyt-ACO)酶液；沉淀用提取液定容至2 mL，用于測定煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-異檸檬酸脫氫酶(NAD-IDH)活性。另外3 mL加入等體積提取液，取其中4 mL在大量透析液(即提取緩沖液)中4 ℃透析過夜，即得PEPC、CS酶液。各項(xiàng)操作均在0～4 ℃下進(jìn)行。

研磨緩沖液：0.2 mol/L Tris-HCl(pH值8.2)、0.6 mol/L蔗糖、10 mmol/L異抗壞血酸；提取緩沖液：0.2 mol/L Tris-HCl(pH值8.2)、10 mmol/L 異抗壞血酸、0.1% TritonX-100。

1.2.3.2 酶活性的測定 參考HIRAI[15]和羅安才等[17]的方法。測定的反應(yīng)體系為3 mL，各種酶活性分析反應(yīng)體系：PEPC反應(yīng)液含0.8 mol/L Tris-HCl(pH值8.5) 300 μL、0.01 mol/L還原型谷胱甘肽(GSH) 150 μL、3 mmol/L還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH) 150 μL、0.04 mol/L MgCl2150 μL、0.2 mol/L KHCO3150 μL、酶液500 μL、4 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸(PEP) 1 600 μL，紫外波長 340 nm。CS反應(yīng)液含0.8 mol/L Tris-HCl (pH值9.0) 300 μL、0.8 mmol/L 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB) 150 μL、0.8 mmol/L乙酰輔酶A(acetyl-CoA) 150 μL、超純水300 μL、酶液800 μL、0.08 mol/L草酰乙酸(OAA) 1 300 μL，紫外波長 412 nm。NAD-IDH反應(yīng)液含0.8 mol/L Hepes (pH值9.0) 300 μL、4 mmol/L MnSO4150 μL、16 mmol/L NAD 150 μL、超純水600 μL、酶液1 200 μL、20 mmol/L異檸檬酸鈉600 μL，紫外波長為340 nm。ACO反應(yīng)液含0.8 mol/L Tris-HCl(pH值7.5)300 μL、2 mmol/L NaCl 150 μL、超純水450 μL、酶液1 200 μL、2 mmol/L烏頭酸900 μL，紫外波長為340 nm，測定前酶液用等體積2 mmol/L GSH在30 ℃共培養(yǎng)1 h。加入反應(yīng)底物后立即用UV-2450型紫外分光光度計(jì)測定吸光度，以5 s為單位掃描3 min，記錄吸光度變化，重復(fù)3次，以每分鐘吸光度變化0.01為1個(gè)酶單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)可滴定酸含量的變化

由圖1可知，設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)可滴定酸含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，設(shè)施內(nèi)果實(shí)可滴定酸含量是從盛花后第5周開始一直升高，到盛花后第8周達(dá)到峰值(1.35%)，然后下降，到盛花后第9～10周含量稍有升高，然后一直到成熟采收呈下降趨勢，成熟時(shí)果實(shí)可滴定酸含量為0.49%。露地果實(shí)可滴定酸含量從盛花后第5周開始呈上升趨勢，到盛花后第6周可滴定酸含量達(dá)到最高值(1.00%)，然后一直下降直到成熟采收，成熟時(shí)果實(shí)可滴定酸含量為0.27%。通過顯著性分析可知，盛花后第6周之前，設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)可滴定酸含量顯著低于露地，盛花后第7～12周，設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)可滴定酸含量均顯著高于露地桃果實(shí)。

不同小寫字母表示同一時(shí)期設(shè)施內(nèi)外差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)有機(jī)酸含量的變化

2.2.1 蘋果酸含量 設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)蘋果酸含量呈先升高再降低的趨勢，在盛花后第6周達(dá)到最大值，為1.62 g/L，然后到盛花后第8周蘋果酸含量基本平穩(wěn)，從盛花后第9周開始蘋果酸含量急速下降，到成熟時(shí)設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)蘋果酸含量為0.73 g/L。露地桃果實(shí)蘋果酸含量呈先升高后下降再升高的趨勢，到盛花后第6周達(dá)到最高值(0.95 g/L)，然后開始下降，到盛花后第9周下降到最低值(0.16 g/L)，之后到盛花后第12周蘋果酸含量一直升高，到成熟采收時(shí)為0.56 g/L。整個(gè)生長發(fā)育過程中設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)蘋果酸含量一直顯著高于露地桃果實(shí)(圖2A)。

2.2.2 檸檬酸含量 設(shè)施內(nèi)和露地桃果實(shí)檸檬酸含量均呈先升高后降低的變化趨勢。設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)檸檬酸含量在盛花后第5周開始呈上升趨勢，第9周達(dá)到最大值(0.59 g/L)，經(jīng)過2周的平穩(wěn)期后開始迅速下降，到盛花后第12周下降到0.37 g/L。露地桃果實(shí)檸檬酸含量于盛花后第5周開始升高，盛花后第7周升高到最大值(0.65 g/L)，之后檸檬酸含量顯著降低，盛花后第12周達(dá)到最低值(0.15 g/L)。果實(shí)發(fā)育過程中，盛花后第5～8周桃果實(shí)檸檬酸含量均為露地顯著高于設(shè)施內(nèi)，盛花后第9～12周均為設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)檸檬酸含量顯著高于露地桃果實(shí)(圖2B)。

2.2.3 奎寧酸和莽草酸含量 設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)奎寧酸含量總體呈先升高后降低的趨勢(圖2C)。設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)奎寧酸含量在盛花后第5～8周緩慢升高，第8周達(dá)到最大值(1.79 g/L)，后期顯著降低，盛花后第12周桃果實(shí)中奎寧酸含量達(dá)到最小值(0.34 g/L)。露地桃果實(shí)奎寧酸含量在盛花后第5～7周變化較平穩(wěn)，盛花后第7周桃果實(shí)奎寧酸含量開始顯著降低，盛花后第9周下降到0.31 g/L，后期變化緩慢。果實(shí)發(fā)育過程中，盛花后第8周之后設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)奎寧酸含量均顯著高于露地桃果實(shí)。

設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)莽草酸含量整體呈下降趨勢。設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)莽草酸含量由盛花后第5周(0.066 g/L)開始下降，盛花后第12周，果實(shí)莽草酸含量為0.024 g/L。露地桃果實(shí)中莽草酸含量在盛花后第5周開始降低，到盛花后第9周下降到最低值(0.016 g/L)，盛花后第10周開始到果實(shí)成熟采收，莽草酸含量略有升高，但差異不顯著。在整個(gè)桃果實(shí)生長發(fā)育期，設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)中莽草酸含量均顯著高于露地桃(圖2D)。

圖2 設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)有機(jī)酸含量的變化Fig.2 Changes of organic acid content inside and outside the greenhouse

2.2.4 設(shè)施內(nèi)外桃成熟果實(shí)中各酸組分所占比例 由表1可知，設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)成熟時(shí)，蘋果酸所占比例最高，分別為49.62%和56.47%，說明春美桃是蘋果酸型果實(shí)。設(shè)施內(nèi)成熟桃果實(shí)檸檬酸含量所占比例高于露地桃，同時(shí)也高于設(shè)施內(nèi)桃奎寧酸所占比例，而露地桃果實(shí)奎寧酸所占比例高于檸檬酸。設(shè)施內(nèi)外成熟桃果實(shí)莽草酸所占比例均較低。

表1 設(shè)施內(nèi)外桃成熟果實(shí)中各酸組分所占比例Tab.1 The proportion of acid components in the mature peach fruit inside and outside the greenhouse %

2.3 設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)檸檬酸代謝相關(guān)酶活性的變化

設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)PEPC活性在盛花后第11周之前總體呈上升趨勢，第11周達(dá)到最大值，為42.37 U/(g·min)，在果實(shí)成熟采收時(shí)降至最低；露地桃果實(shí)PEPC活性在盛花后第6周達(dá)到最高值[30.59 U/(g·min)]，然后急劇下降至盛花后第7周，此時(shí)設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)PEPC活性差異不顯著，盛花后第7周至果實(shí)采收時(shí)PEPC活性變化幅度不大。設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)PEPC活性差異比較表明，整個(gè)生長發(fā)育過程中除盛花后第5、7、12周外，設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)PEPC活性均顯著高于設(shè)施外桃果實(shí)(圖3A)。

設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)CS活性呈雙峰變化的趨勢(圖3B)，首個(gè)高峰出現(xiàn)在盛花后第8周，峰值為3.58 U/(g·min)，此時(shí)桃果實(shí)CS活性顯著高于露地桃果實(shí)，第8周后迅速降低，到盛花后第10周達(dá)到第2個(gè)峰值，為2.64 U/(g·min)，此時(shí)桃果實(shí)CS活性顯著高于露地桃果實(shí)。露地桃果實(shí)CS活性整體呈先升高后降低的趨勢，盛花后第6周達(dá)到最高值[2.49 U/(g·min)]，后期緩慢降低，盛花后第11周CS活性達(dá)到最低值，為0.39 U/(g·min)，顯著低于設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)。

設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)NAD-IDH活性均呈先上升后降低的趨勢，且均在盛花后第8周達(dá)到最大值，分別為1.00、0.97 U/(g·min)，差異不顯著，第8周前設(shè)施內(nèi)外NAD-IDH活性雖有變化，但變化幅度較小，設(shè)施內(nèi)NAD-IDH活性顯著高于露地桃果實(shí)，第8周后設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)中NAD-IDH活性均顯著降低，但設(shè)施內(nèi)外差異不顯著(圖3C)。

設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)Cyt-ACO活性在整個(gè)生長期均呈先下降后升高再下降的變化趨勢。盛花后第5～7周設(shè)施內(nèi)外果實(shí)Cyt-ACO活性均有小幅度下降，但設(shè)施內(nèi)外差異不顯著，第7周后設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)Cyt-ACO活性呈上升趨勢，盛花后第9周達(dá)到最大值，分別為0.81、1.47 U/(g·min)。此時(shí)設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)Cyt-ACO活性顯著低于露地桃果實(shí)，第9周后設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)中Cyt-ACO活性均呈下降趨勢，且設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)中Cyt-ACO活性高于露地桃果實(shí)(圖3D)。

圖3 設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)檸檬酸代謝相關(guān)酶活性的變化Fig.3 Changes of emzyme activities of citric acid inside and outside the greenhouse

2.4 設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)檸檬酸含量與代謝相關(guān)酶活性間相關(guān)性分析

由表2可知，設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)檸檬酸含量與PEPC和CS活性呈正相關(guān)，其中，與PEPC活性呈顯著正相關(guān)(r=0.690*)，與NAD-IDH和Cyt-ACO活性呈負(fù)相關(guān)，其中，與NAD-IDH活性呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.820**)，表明設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)中PEPC活性升高可以促進(jìn)檸檬酸的積累；露地桃果實(shí)中檸檬酸含量與PEPC和CS活性呈正相關(guān)，與NAD-IDH和Cyt-ACO活性呈負(fù)相關(guān)，但均未達(dá)到顯著水平。

表2 檸檬酸含量與代謝相關(guān)酶活性間相關(guān)性分析Tab.2 Analysis of correlation between the content of citric acid and the metabolism enzyme activities

注:*、**分別表示0.05、0.01相關(guān)水平。

Note: * and ** mean significant at 0.05 and 0.01 levels.

3 結(jié)論與討論

對(duì)楊梅[18]、柑橘[19]等的研究結(jié)果表明，設(shè)施栽培對(duì)果實(shí)品質(zhì)有重要的影響，設(shè)施內(nèi)外果實(shí)中酸含量有差異，從而影響了果實(shí)的風(fēng)味形成。本研究以春美桃為試材，結(jié)果表明，設(shè)施內(nèi)外桃可滴定酸含量變化趨勢相同，設(shè)施內(nèi)早期(盛花后第6周前)果實(shí)中可滴定酸含量低于露地果實(shí)，后期高于露地果實(shí)，到采收時(shí)可滴定酸含量高于露地果實(shí)。關(guān)于設(shè)施內(nèi)外不同環(huán)境對(duì)果實(shí)有機(jī)酸含量影響的原因，錢皆兵等[20]認(rèn)為，設(shè)施內(nèi)外土壤理化性質(zhì)不同，設(shè)施內(nèi)土壤的全鹽量明顯高于露地土壤，氮、磷、鉀含量比露地略有升高，因此設(shè)施內(nèi)外果實(shí)有機(jī)酸含量不同。趙雪惠等[21]研究表明，對(duì)設(shè)施內(nèi)的油桃補(bǔ)充藍(lán)光降低了油桃有機(jī)酸含量。馬凱等[22]研究表明，設(shè)施內(nèi)通過人工加富CO2可以提高果實(shí)品質(zhì)。

果實(shí)中的有機(jī)酸含量是果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，不同種類果實(shí)有機(jī)酸組成及其含量存在顯著差異。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，設(shè)施內(nèi)外春美桃果實(shí)有機(jī)酸組分有蘋果酸、檸檬酸、莽草酸和奎寧酸，其中蘋果酸含量分別占有機(jī)酸含量的49.62%和56.47%，是春美桃果實(shí)的主要有機(jī)酸。但果實(shí)成熟時(shí)設(shè)施內(nèi)春美桃果實(shí)檸檬酸所占比例明顯升高，設(shè)施內(nèi)外總酸含量相差0.47 g/L，其中，蘋果酸含量的差異占總差異的34.94%，檸檬酸含量的差異占總差異的47.67%，說明設(shè)施內(nèi)外檸檬酸含量的差異是造成果實(shí)成熟時(shí)酸味差異的主要原因。本研究還發(fā)現(xiàn)，桃果實(shí)檸檬酸含量整體呈先升高后降低的趨勢，果實(shí)發(fā)育前期露地果實(shí)檸檬酸含量顯著高于設(shè)施內(nèi)果實(shí)，果實(shí)發(fā)育后期露地果實(shí)檸檬酸含量顯著低于設(shè)施內(nèi)。果實(shí)有機(jī)酸含量的高低由果實(shí)生長發(fā)育過程中有機(jī)酸合成和降解共同決定[23-24]。有研究表明，在胞質(zhì)中PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸β-羧化生成OAA，OAA在MDH作用下產(chǎn)生蘋果酸。OAA和蘋果酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)生成檸檬酸和其他代謝產(chǎn)物[25]。本研究結(jié)果表明，整個(gè)生長發(fā)育過程中設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)PEPC活性顯著高于露地果實(shí)。相關(guān)性分析表明，設(shè)施內(nèi)PEPC活性與檸檬酸含量存在顯著正相關(guān)關(guān)系，設(shè)施外PEPC活性與檸檬酸含量存在正相關(guān)關(guān)系，但不顯著，說明PEPC活性對(duì)設(shè)施內(nèi)檸檬酸含量的影響大于露地。此結(jié)果與MOING等[26]的PEPC有效促進(jìn)了桃發(fā)育過程中有機(jī)酸的合成和積累的研究結(jié)果相符。相關(guān)性分析還表明，設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)CS活性與檸檬酸含量呈正相關(guān)關(guān)系，但均不顯著，NAD-IDH和Cyt-ACO活性與檸檬酸含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)NAD-IDH活性與檸檬酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，其余相關(guān)性不顯著，說明PEPC和CS促進(jìn)檸檬酸的積累，而NAD-IDH和Cyt-ACO促進(jìn)檸檬酸的降解，這與前人在棗[27]、果梅[28]、山葡萄[29]上的研究結(jié)果一致。果實(shí)發(fā)育前期，設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)NAD-IDH活性顯著高于露地果實(shí)，導(dǎo)致設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)檸檬酸降解速度大于露地果實(shí)，從而使設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)檸檬酸含量顯著低于露地果實(shí)。果實(shí)發(fā)育后期，設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)PEPC和CS活性顯著高于露地，而NAD-IDH活性僅在盛花后第10周差異顯著，致使設(shè)施內(nèi)檸檬酸合成量高于露地，從而使設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)檸檬酸含量顯著高于露地桃果實(shí)，說明桃果實(shí)發(fā)育前期NAD-IDH活性對(duì)檸檬酸含量的調(diào)控作用較大，而果實(shí)發(fā)育后期PEPC和CS活性對(duì)檸檬酸含量調(diào)控作用較大。

綜上所述，春美桃果實(shí)為蘋果酸型果實(shí)，但成熟期設(shè)施內(nèi)外桃果實(shí)有機(jī)酸含量的差異主要由檸檬酸引起，設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)PEPC活性和果實(shí)發(fā)育后期CS活性較高是導(dǎo)致設(shè)施內(nèi)桃果實(shí)酸性較高的主要原因。