李 浪，張澤俊，張正彪，范賢林

（昭通學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昭通 657000）

1 前言

魔芋（Konjac，為天南星科魔芋屬多年生宿根性草本耐陰植物的地下塊蓮，學(xué)名為藤龍，又名鬼芋、花桿蓮、天南星等，中藥稱蛇六谷）[1]。有學(xué)名的魔芋屬種已有170 多種，塊莖呈扁圓型、葉柄呈圓柱形、掌狀復(fù)葉呈淡綠色多帶有暗紫色斑點(diǎn)，株高40 至70 公分，生長于疏林下，開紫紅色花，最早發(fā)現(xiàn)于斯里蘭卡和印度。我國早在一千多年前就已經(jīng)開始種植，在晉朝的《蜀都賦》中就有詳細(xì)記載[2]?，F(xiàn)主要生長在我國湖北、云南、四川等地，是我國的一種古典醫(yī)藥[3]。魔芋是一種藥食兩用的多年生草本植物，果實(shí)中含大量的葡甘聚糖及豐富的生物堿、黃酮、淀粉、神經(jīng)酰胺、纖維素和礦物質(zhì)等多種功能性成分，均具有明顯的生物活性。魔芋果實(shí)具有多種特性其中包括高纖維、低蛋白、低脂肪、膨脹率高等，其藥用功效方面還具有降三高、抗氧化、保健美容、抗癌解毒等多種療效[4-6]，具有廣闊的市場前景。

魔芋中的蛋白質(zhì)是人體極為重要的營養(yǎng)物質(zhì)，是生物體細(xì)胞組織構(gòu)成的重要成分之一。蛋白質(zhì)與人體的營養(yǎng)代謝、氧氣運(yùn)輸、信息交流、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)免疫和遺傳物質(zhì)等相關(guān)[7]，具有構(gòu)成機(jī)體、修復(fù)組織、構(gòu)成酶和激素等活性物質(zhì)、供給機(jī)體能量等生理功能，也是人體中氮的唯一來源，具有糖類和脂肪不可替代的作用[8]。目前而言，國內(nèi)對昭通魔芋中各種有效成分提取分離所得的產(chǎn)品純度還不高，使得魔芋的利用率不高造成資源浪費(fèi)，沒有實(shí)現(xiàn)真正意義上的綜合利用。測定蛋白質(zhì)含量的方法有經(jīng)典的方法和先進(jìn)的方法，其中經(jīng)典的方法包括雙縮脲試劑法、Folin-酚試劑法、紫外吸收測定法、考馬斯亮藍(lán)法等；先進(jìn)的方法包括近紅外光譜(Near Infrared Espectroscopy，簡稱NIR)分析技術(shù)、膠體金染色法、杜馬斯燃燒法、流動(dòng)注射分析法等[9]。雙縮脲試劑法本身具有試劑單一、干擾物質(zhì)較少、呈色性好、操作簡單、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)[10]，但靈敏度低需要把樣品稀釋至蛋白質(zhì)濃度為1～10 mg/mL，這時(shí)測定結(jié)果較準(zhǔn)確，所以本實(shí)驗(yàn)采用雙縮脲試劑法作為首選測定方法[11,12]。本實(shí)驗(yàn)對昭通市5 個(gè)不同地區(qū)花魔芋中蛋白質(zhì)含量測定的研究，為魔芋產(chǎn)品的附加值提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的花魔芋采自昭陽區(qū)、彝良縣、大關(guān)縣、鎮(zhèn)雄縣、永善縣5 個(gè)地區(qū)。將花魔芋洗凈后切片，置于40℃烘箱烘干，烘干后的魔芋經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后置于60 目，制得魔芋干粉，并于清潔干燥處放置，備用。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備與主要試劑

2.2.1 儀器設(shè)備

DFT-250A 手提式高速萬能粉碎機(jī)（浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司）、EP64C 專業(yè)型分析天平（0.0001 g）（美國奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）、HH-S24 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市金壇友聯(lián)儀器研究所）、721 型可見分光光度計(jì)（山東高密彩虹分析儀器有限公司）、800 型離心沉淀器（上海手術(shù)器械廠）、DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海-恒科技有限公司）。

2.2.2 試劑

四氯化碳（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、酒石酸甲鈉（成都化學(xué)試劑廠）、硫酸銅（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、碘化鉀（廣東光華化學(xué)廠有限公司）、氫氧化鈉（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、牛血清蛋白（美侖生物化學(xué)試劑科技有限公司）以上藥品均是分析純。

雙縮脲試劑A 液配制：將0.1250 mol 氫氧化鈉放入100 mL 燒杯中溶解移入250 mL 容量瓶中定容，得0.5 mol/L 氫氧化鈉溶液。B 液配制：將0.004 mol 硫酸銅（1 g）、0.0040 mol 碘化鉀和2.5000 g 酒石酸甲鈉依次加入100 mL 燒杯中溶解后移入250 mL 容量瓶中定容，得0.0160 mol/L 硫酸銅溶液。

0.0500 mol/L 氫氧化鈉溶液：將0.0500 g 氫氧化鈉放入100 mL 燒杯中溶解移入250 mL 容量瓶中定容備用。

5 mg/mL 的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取0.2500 g牛血清蛋白于燒杯中用0.0500 mol/L 的氫氧化鈉溶液溶解，移入50 mL 容量瓶中用0.0500 mol/L 的氫氧化鈉溶液定容備用。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

在比較紫外吸收測定法、雙縮脲試劑法、考馬斯亮藍(lán)法、Folin-酚試劑法四種方法測得蛋白質(zhì)含量之間差異均不顯著[12]。蛋白質(zhì)中均含有碳、氫、氧、氮四種元素，其中含量最恒定的為氮元素，占16%左右[13]，蛋白質(zhì)含有2 個(gè)以上肽鍵。在強(qiáng)堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，與硫酸銅形成紫色絡(luò)合物，該絡(luò)合物顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，所以根據(jù)氮元素的含量進(jìn)行推算魔芋中蛋白質(zhì)的含量。雙縮脲試劑法能夠有效地消除脂肪、糖類等物質(zhì)的干擾，其精密度與準(zhǔn)確度較高，有利于提高實(shí)驗(yàn)效率，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用[14]。雙縮脲法測定速度較快(約60 min)、對蛋白質(zhì)呈色定性好、干擾物少、操作簡便、不必提純蛋白質(zhì)，但靈敏度低需要把樣品稀釋至蛋白質(zhì)濃度為1～10 mg/mL，這時(shí)測定結(jié)果較準(zhǔn)確。雙縮脲試劑法利用721 型分光光度計(jì)測定吸光度值，可直接測定蛋白質(zhì)含量[15,16]因此作為本實(shí)驗(yàn)方法。

2.3.1 最大吸收波長

在10 mL 容量瓶中加入2 mL 含量為5 mg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，再加入0.5 mL 蒸餾水，用7.5 mL 雙縮脲試劑定容，搖勻靜置5min。然后于721型分光光度計(jì)在波長370 至580 nm 下，每間隔10 nm 測定吸光度確定最大吸收波長范圍，再以每間隔2 nm 測定吸光度確定最大吸收波長。以0 mL的標(biāo)準(zhǔn)液2.5 mL 蒸餾水7.5 mL 雙縮脲試劑定容為空白試劑對照比色，多次實(shí)驗(yàn)選用最佳數(shù)據(jù)確定最大吸收波長。

2.3.2 單因素試驗(yàn)

為了確定魔芋蛋白質(zhì)最佳測定工藝條件，研究了四氯化碳的量和測定溫度對魔芋蛋白質(zhì)的影響作用。

2.3.2.1 四氯化碳量的影響

用制得的魔芋干粉樣品準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于25 mg蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)入5 個(gè)標(biāo)記好的25 mL 容量瓶中，分別準(zhǔn)確加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 四氯化碳，24.5、24、23.5、23.0、22.5 mL 雙縮脲試劑定容。分別劇烈震蕩10min 靜置15min，用4000 r/min 的離心沉淀器離心5min 后取出清液。分別取4 mL清液于10 mL 容量瓶中用雙縮脲試劑定容，以空白試劑對照比色，多次實(shí)驗(yàn)選用最佳數(shù)據(jù)確定加入四氯化碳的量。

2.3.2.2 溫度的影響

用制得的魔芋干粉樣品準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于25 mg 蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)入錐形瓶，加入0.5 mL 四氯化碳24.5 mL 雙縮脲試劑后放入數(shù)顯恒溫水浴鍋中（從20℃至60℃每次升高5℃）劇烈震蕩10min，靜置15min，用4000 r/min 的離心沉淀器離心5min 后取出清液。分別取4 mL 清液于10 mL 容量瓶中用雙縮脲試劑定容，以空白試劑對照比色，做多次實(shí)驗(yàn)選用最佳數(shù)據(jù)確定實(shí)驗(yàn)溫度。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法

以牛血清蛋白制得的含量為5 mg/mL 的蛋白質(zhì)溶液為標(biāo)準(zhǔn)樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用6 個(gè)10mL 的容量瓶做好標(biāo)記分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，再分別加入2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0 mL 蒸餾水，最后用7.5 mL 雙縮脲試劑定容，搖勻靜置5min 用721 型分光光度計(jì)在波長550 nm下以0 mL 的標(biāo)準(zhǔn)液容量瓶為空白對照比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.4 樣品蛋白質(zhì)含量測定

用制得的魔芋干粉樣品準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于25 mg蛋白質(zhì)樣品，分別轉(zhuǎn)入5 個(gè)標(biāo)記好的25 mL 容量瓶中，加入上述最佳四氯化碳量，用雙縮脲試劑定容。分別劇烈震蕩10min 靜置15min，用4000 r/min 的離心沉淀器離心5min 后取出清液，分別吸取4 mL 清液于10 mL 容量瓶中，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法，測定實(shí)驗(yàn)樣品的吸光度值，做三次平行實(shí)驗(yàn)計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 最大吸收波長結(jié)果

按2.3.1 實(shí)驗(yàn)方法用721 型分光光度計(jì)在波長370 nm 至580 nm 下測定吸光度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明波長540 nm 至560 nm 有最佳測定波長，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1，由圖1已知在550 nm 處為最佳測定波長。

表1 最大吸收波長結(jié)果Tab.1 Maximum absorption wavelength results

圖1 最大吸收波長結(jié)果Fig.1 Maximum absorption wavelength result

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程建立

按2.3.3 實(shí)驗(yàn)方法用721 型分光光度計(jì)在波長550 nm 下測定吸光度，結(jié)果如表2圖2所示，以吸光度為橫坐標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為：Y=8.29X +0.036，其中牛血清蛋白濃度(X)和吸光度(Y)的相關(guān)系數(shù)R2=0.9998 方程的線性良好可應(yīng)用。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果Tab.2 Standard curve production results

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果Fig.2 Standard curve production results

3.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 四氯化碳量的影響

按2.3.2.1 實(shí)驗(yàn)方法用721 型分光光度計(jì)在波長550 nm 下測定吸光度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，由表已知四氯化碳最佳使用量1.5 mL。

表3 四氯化碳的量結(jié)果Tab.3 Results of the amount of carbon tetrachloride

3.3.2 溫度的影響

按2.3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法用721 型分光光度計(jì)在550 nm 波長、1.5 mL 四氯化碳條件下測定吸光度。如表4所示實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)蛋白質(zhì)失去活性無法測定，溫度在20 ℃至50 ℃范圍雙縮脲法對蛋白質(zhì)產(chǎn)生的顏色反應(yīng)影響較小可忽略不計(jì)[17]。

表4 溫度的影響結(jié)果Tab.4 The effect of temperature

3.4 樣品蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果

按2.3.4 實(shí)驗(yàn)方法用721 型分光光度計(jì)在波長為550 nm、室溫、1.5 mL 四氯化碳條件下測定，結(jié)果顯示：如表5所示不同地區(qū)魔芋中蛋白質(zhì)的含量不同，昭陽區(qū)（2.04%）＞彝良縣（2.02%）＞大關(guān)縣（1.98%）＞鎮(zhèn)雄縣（1.72%）＞永善縣（1.27%）。

表5 樣品測定結(jié)果Tab.5 Sample measurement results

3.5 測定方法的檢驗(yàn)

按標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=8.29X + 0.036 回歸方程計(jì)算所有的結(jié)果。

3.5.1 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液(5 mg/mL)0.5 mL 進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，連續(xù)進(jìn)行6 次測定其吸光度，如表6所示得RSD=4.6%，結(jié)果小于5%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明精密度好。

表6 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Precision experiment results

3.5.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一樣品溶液1 mL，每隔10 min 測定1 次，比較穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示得RSD=1.2%，由表已知在顯色60 min時(shí)間內(nèi)吸光度穩(wěn)定性較好。

表7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Stability experiment results

3.5.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一原料樣品，多次配制每次取1 mL 樣品液按樣品測定方法，分別測定其吸光度，檢驗(yàn)該測定方法的重現(xiàn)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8所示得RSD=3.60%，結(jié)果小于5%，表明重復(fù)性較好。

表8 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Reproducibility experiment results

3.5.4 回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取已配制的1 mg/mL 樣品溶液1 mL，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述樣品測定方法分別測定其吸光度，計(jì)算回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表9所示樣品平均回收率均為114.96%，RSD 為4.95%，表明本法可行[18]。

表9 回收率實(shí)驗(yàn)Tab.9 Recovery rate experiment

4 結(jié)論

本研究選用昭通市花魔芋資源作為研究對象，對5 個(gè)不同地方花魔芋的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行研究比較，用雙縮脲試劑法對不同地區(qū)魔芋中蛋白質(zhì)進(jìn)行含量的測定，結(jié)果顯示：不同地區(qū)魔芋中蛋白質(zhì)的含量不同且昭陽區(qū)（2.04%）＞彝良縣（2.02%）＞大關(guān)縣（1.98%）＞鎮(zhèn)雄縣（1.72%）＞永善縣（1.27%）。由實(shí)驗(yàn)已知雙縮脲法在波長為550 nm下測定魔芋蛋白質(zhì)時(shí)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度在1～10 mg/mL 范圍內(nèi)，線性關(guān)系比較好，變異系數(shù)小，重復(fù)性好，平均回收率和精密度都很高。該方法快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，為快速測定植物中蛋白質(zhì)成分含量提供了重要參考[19]雙縮脲試劑法測定魔芋蛋白質(zhì)含量所需時(shí)間少，操作簡單，對環(huán)境無污染，是一種非常有前途的測定蛋白質(zhì)的方法[20]。魔芋中蛋白質(zhì)是人體極為重要的營養(yǎng)物質(zhì)，是生物體細(xì)胞組織構(gòu)成的重要成分之一。蛋白質(zhì)含量的多少也是反映食品營養(yǎng)價(jià)值和用途的重要指標(biāo)，同時(shí)也決定著食品的商業(yè)價(jià)值，因此實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)含量的快速準(zhǔn)確測定不僅是滿足人們的營養(yǎng)需求，而且在一定程度上保障了消費(fèi)者的合法權(quán)益。但目前由于技術(shù)水平的限制，蛋白質(zhì)檢測儀方法還需要進(jìn)一步改進(jìn)。探索藥品儀器測定不同種類蛋白質(zhì)的原理，實(shí)現(xiàn)高速、精確的技術(shù)檢測體系，以滿足人們對各種蛋白質(zhì)的測定。