楊沔 沈迎春 賀海斌 錢海龍 俞仲輝 江州華 裘豐

生物節(jié)律的破壞是導(dǎo)致人類結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)生、發(fā)展的內(nèi)源性因素之一[1-3]。盡管哺乳類動(dòng)物的晝夜節(jié)律已被廣泛研究，但多數(shù)研究只是基于轉(zhuǎn)錄水平的負(fù)性調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后水平的修飾[4]。近年來，有學(xué)者致力于微小RNA（microRNA，miRNA）的研究。miRNA幾乎可以調(diào)控整個(gè)細(xì)胞代謝進(jìn)程，如細(xì)胞增殖、凋亡等[5-7]。miR-124作為腫瘤抑癌基因，通過一些特殊靶點(diǎn)（如STAT3、SMC4、iASPP等）發(fā)揮CRC抑制作用也常被報(bào)道[8-11]。但是，miR-124與生物鐘基因hClock之間是否存在調(diào)控作用尚未清楚。本研究就miR-124通過hClock調(diào)控人CRC進(jìn)展的機(jī)制作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年12月至2016年12月在寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院東部院區(qū)行CRC根治術(shù)的50例患者為研究對象，所有患者術(shù)后病理檢查證實(shí)為CRC，術(shù)前均未行放化療。其中男28例，女22例；年齡35～82（56.3±13.8）歲。術(shù)中將患者的癌組織標(biāo)本立即投入液氮中暫存，術(shù)后放入-80℃冰箱保存待檢。

1.2 hClock蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化染色法。取癌組織標(biāo)本，甲醛固定、石蠟包埋、切片（4 μm 厚）；脫蠟、切片、水化、枸櫞酸緩沖液（0.01 M，pH 6.0）10 min微波抗原修復(fù)；單克隆抗體 hClock（cat#5157，1:100 dilution，美國Cell signaling Technology公司）4℃孵育過夜。PBS簡單清洗后，加二抗（#A31460，1:500 dilution，美國Thermo Fisher公司）37°C孵育60 min。PBS再次清洗，DAB顯色試劑盒染色5～10 min，常規(guī)蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min，在光學(xué)顯微鏡（×400）下觀察細(xì)胞染色情況。由2位病理科醫(yī)生獨(dú)立評估染色強(qiáng)度（無著色為0分，弱著色為1分，中度著色為2分，強(qiáng)著色為3分）及染色細(xì)胞百分比，計(jì)算免疫組化評分。免疫組化評分=染色強(qiáng)度評分×染色細(xì)胞百分比，≥1.5分為hClock蛋白高表達(dá)，＜1.5分為hClock蛋白低表達(dá)。

1.3 miR-124表達(dá)檢測 采用qPCR法。（1）RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄：用Trizol試劑提取CRC組織樣本中的總RNA，分光光度計(jì)檢測總RNA含量?？俁NA通過特異的miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及miR-124莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。引物序列：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCATTC-3'。（2）PCR反應(yīng)：加入SYBR-green的成熟miR-124的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，在PCR儀（Corbett，美國Bio-Rad公司）上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系包括 cDNA 4 μl、10 mmol/L引物4 μl（上、下游引物各2 μl）、PCR Master Mix 10 μl、水2μl，最終配成20 μl反應(yīng)體系。反應(yīng)參數(shù)：95℃5 min；95℃5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 5 s，40個(gè)循環(huán)。qPCR 引物序列：正義為 5'-GCTAAGGCACGCGGTG-3'，反義為 5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。根據(jù)每例患者癌組織與癌旁正常組織miR-124相對表達(dá)量的比值不同分為兩組，即miR-124低表達(dá)組（比值＜2）和miR-124高表達(dá)組（比值≥2）[12-13]。

1.4 miR-124生物信息學(xué)靶點(diǎn)預(yù)測 采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。使用3種靶點(diǎn)預(yù)測軟件TargetScan（http://www.targetscan.org）、PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/cgibin/new_vertebrare.org）、miRNA.org（http://www.microrna.org）對miRNA在hClock 3'-非翻譯區(qū)上的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。將野生型或突變型的hClock 3'-非翻譯區(qū)基因克隆到雙熒光素酶報(bào)告基因中，進(jìn)一步驗(yàn)證hClock是否為miR-124的直接調(diào)控靶點(diǎn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。CRC患者癌組織miR-124表達(dá)與hClock蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征CRC患者癌組織hClock蛋白高表達(dá)率比較 CRC患者癌組織hClock蛋白高表達(dá)率為52.0%（26/50）。不同TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織hClock蛋白高表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；不同性別、年齡及腫瘤位置、組織學(xué)分級、浸潤深度的患者癌組織hClock蛋白高表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

2.2 不同臨床特征CRC患者癌組織miR-124低表達(dá)率比較 CRC患者癌組織miR-124低表達(dá)率為68.0%（34/50）。有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織miR-124低表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同性別、年齡及腫瘤位置、組織學(xué)分級、浸潤深度、TNM分期的患者癌組織miR-124低表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表 2。

2.3 CRC患者癌組織miR-124表達(dá)與hClock蛋白表達(dá)的關(guān)系 CRC患者癌組織miR-124低表達(dá)34例，高表達(dá)16例。miR-124高表達(dá)組hClock蛋白表達(dá)的免疫組化評分為（1.13±0.61）分，明顯低于miR-124低表達(dá)組的（1.71±0.54）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.67，P＜0.05），免疫組化染色結(jié)果見圖1。CRC患者癌組織miR-124相對表達(dá)量與hClock蛋白表達(dá)的免疫組化評分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.798，P＜0.01）。

表1 不同臨床特征CRC患者癌組織hClock蛋白高表達(dá)率比較[例（%）]

圖1 miR-124高、低表達(dá)組結(jié)直腸癌（CRC）患者癌組織中hClock蛋白表達(dá)情況（a：miR-124高表達(dá)組；b：miR-124低表達(dá)組；免疫組化染色，×400）

2.4 miR-124生物信息學(xué)靶點(diǎn)預(yù)測 3種常用的靶點(diǎn)預(yù)測信息軟件（TargetScan、PicTar、miRNA.org）都預(yù)測到miR-124-3p可能與hClock 3'-非翻譯區(qū)相結(jié)合；經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，推測hClock可能是miR-124的直接調(diào)控靶點(diǎn)，見圖2。

3 討論

當(dāng)前，雖然CRC的治療策略有了較大的進(jìn)步，但是患者預(yù)后仍較差。對CRC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，可能對進(jìn)一步完善治療策略具有重要價(jià)值[14-15]。生物鐘基因調(diào)控的晝夜節(jié)律紊亂可能是CRC發(fā)生、發(fā)展的內(nèi)源性因素之一。但是作為核心生物鐘基因的hClock在CRC發(fā)生、發(fā)展中的具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全清楚。

表2 不同臨床特征CRC患者癌組織miR-124低表達(dá)率比較[例（%）]

本研究通過生物信息學(xué)對調(diào)節(jié)hClock的miRNA進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-124直接與hClock 3'-非翻譯區(qū)相結(jié)合。相關(guān)研究表明，miR-124在CRC中表達(dá)下調(diào)，然后通過結(jié)合一些特異基因發(fā)揮抑癌基因作用；而miR-124表達(dá)下調(diào)可能與上游啟動(dòng)子甲基化有關(guān)[14]。筆者推測在CRC中，miR-124啟動(dòng)子甲基化可能是決定其表達(dá)下調(diào)而hClock表達(dá)上調(diào)的原因之一。為搞清楚這個(gè)問題，本研究對人CRC組織中miR-124及hClock表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示不同TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織中hClock蛋白高表達(dá)率比較，以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織中miR-124低表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-124高表達(dá)組hClock蛋白表達(dá)的免疫組化評分明顯低于miR-124低表達(dá)組，CRC患者癌組織中miR-124相對表達(dá)量與hClock蛋白表達(dá)的免疫組化評分呈負(fù)相關(guān)。然后使用3種常用的靶點(diǎn)預(yù)測信息軟件，發(fā)現(xiàn)都能預(yù)測到hClock是miR-124的直接調(diào)控靶點(diǎn)。因此，筆者認(rèn)為hClock是miR-124的直接調(diào)控靶點(diǎn)，miR-124通過與hClock 3'-非翻譯區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平對hClock表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

圖2 miR-124生物信息學(xué)靶點(diǎn)預(yù)測（a：在不同物種間，miR-124與hClock的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合的靶序列是段保守序列；b：雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)）

綜上所述，miR-124通過調(diào)控hClock促進(jìn)人CRC的進(jìn)展；miR-124表達(dá)下調(diào)可能是促進(jìn)人CRC進(jìn)展的原因之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為hClock的促癌作用及miR-124的抑癌作用提供了一定的證據(jù)，而在CRC細(xì)胞中hClock是否為miR-124的直接調(diào)控靶點(diǎn)，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。