黃航 李萍 葉雪挺 陳偉 張方毅

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，而且PCa病死人數(shù)占癌癥總病死人數(shù)的3.8%[1]。2015年相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，我國(guó)PCa發(fā)病率及病死率逐年升高，達(dá)26.6/100萬(wàn)[2]，確診時(shí)多處于晚期，且出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。骨轉(zhuǎn)移是PCa最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式，約90%的PCa病死患者合并骨轉(zhuǎn)移[4]。成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞是骨微環(huán)境的重要組成部分[5]，PCa細(xì)胞可以通過(guò)分泌骨形成蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮素-1等骨促進(jìn)因子來(lái)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化，對(duì)骨轉(zhuǎn)移前微環(huán)境進(jìn)行重構(gòu)[6-8]。因此，在治療原發(fā)灶的同時(shí)，對(duì)播散的PCa細(xì)胞和潛在的轉(zhuǎn)移前微環(huán)境進(jìn)行針對(duì)性干預(yù)，有望遏制PCa骨轉(zhuǎn)移灶的形成，改善晚期患者的預(yù)后。外泌體是一種直徑約30～100 nm的細(xì)胞外囊泡[9]，近年來(lái)研究證實(shí)是腫瘤微環(huán)境生態(tài)互動(dòng)中的重要信使，它可以選擇性地包裹特異的RNA、DNA、蛋白和脂類等物質(zhì)，并被腫瘤細(xì)胞釋放到細(xì)胞外，從而介導(dǎo)細(xì)胞間通訊[10]。腫瘤來(lái)源的外泌體釋放入血循環(huán)后，可被靶器官的細(xì)胞攝取并定植，通過(guò)一系列信號(hào)分子啟動(dòng)與靶器官的生態(tài)互動(dòng)，促進(jìn)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的重塑[11-12]。微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類小片段非編碼單鏈RNA，也是目前最受關(guān)注的外泌體信號(hào)分子。有證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的miRNA可借助外泌體的“運(yùn)載”到達(dá)靶器官，通過(guò)調(diào)控靶器官內(nèi)其他細(xì)胞的基因表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞表型及生物學(xué)功能，從而參與轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的構(gòu)建[13-14]。另外，miRNA還可以通過(guò)調(diào)控成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞分化，重構(gòu)骨微環(huán)境，在腫瘤骨轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[15-17]。本研究將PC-3細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hMSC）共培養(yǎng) 48 h，檢測(cè)成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)及礦化面積占比，以探討外泌體miR-940在PCa骨轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）血清標(biāo)本：2017年6月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的3例正常老年男性及3例PCa骨轉(zhuǎn)移患者的血清標(biāo)本。（2）細(xì)胞株：PCa細(xì)胞株為PC-3細(xì)胞，正常前列腺上皮細(xì)胞株為RWPE-1細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命研究院細(xì)胞資源中心；hMSC購(gòu)自深圳華拓生物科技有限公司。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，血清標(biāo)本的獲取取得研究對(duì)象的知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 蛋白質(zhì)定量試劑盒（500-0005）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司；抗-VDAC（ab14734）、抗-D63（ab134045）、抗-Hsp70（ab2787）、抗-CD81（ab155760）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；ECL試劑（320002）購(gòu)自英國(guó)GE Healthcare公司；Trizol（100 ml，15596018）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）購(gòu)自日本 TaKaRa 公司；miR-940 mimic、miR-940 inhibitor購(gòu)自上海吉瑪公司；InvitrogenTMLipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室（MCHT06H48）購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司。RTPCR儀（ABI7900）購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) （1）PC-3細(xì)胞、RWPE-1細(xì)胞均用10% FBS-F12K培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。FBS 4℃、120 000 g離心14 h，獲得無(wú)外泌體FBS；待細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿培養(yǎng)皿80%～90%時(shí)，更換為無(wú)外泌體血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后收集培養(yǎng)液上清液，待后續(xù)外泌體提取。（2）hMSC使用專用培養(yǎng)基（Corning）進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 外泌體的提取和鑒定 （1）血清外泌體提?。貉?℃、300 g離心10 min，收集上清液；30 000 g離心20 min，經(jīng)0.22 μm一次性濾器過(guò)濾后，收集上清液；120 000 g離心 90 min，棄上清液，100 μl PBS 重懸，分裝，貯存于-80℃待用。（2）細(xì)胞外泌體的提取和鑒定：采用差速離心法。取細(xì)胞培養(yǎng)液上清液，300 g離心10 min，取上清液；2 000 g離心10 min，取上清液；10 000 g離心30 min，取上清液；100 000 g離心70 min，棄上清液，PBS重懸；100 000 g離心70 min，所得沉淀即外泌體。在透射電鏡下，對(duì)獲得的外泌體進(jìn)行大小、形態(tài)鑒定；并用Western blot法檢測(cè)外泌體標(biāo)志性蛋白（VDAC、CD63、Hsp70、CD81）表達(dá)：用含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白，用蛋白質(zhì)定量試劑盒定量。在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，每個(gè)泳道上樣40 μg蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含0.1% Tween 20、5% BSA的Tris緩沖鹽溶液（TBST）封閉膜 2 h；再用抗-VDAC、抗-CD63、抗-Hsp70和抗-CD81（1∶1 000稀釋）4℃ 孵育過(guò)夜。次日TBST洗去抗體，PVDF膜分別與二抗結(jié)合（1∶2 000稀釋）孵育2 h；洗去抗體，使用ECL試劑使膜上標(biāo)記的抗體發(fā)生反應(yīng)，暗室曝光，洗膠片，獲得條帶。

1.5 外泌體中miRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。取血清外泌體或細(xì)胞外泌體標(biāo)本，使用Trizol提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；利用ABI7900序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行RT-PCR。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因與管家基因表達(dá)量的比值，即目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 PC-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與PCa-hMSC共培養(yǎng)體系的建立 將未處理的PC-3細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板并補(bǔ)充2 ml相應(yīng)培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染；將 50 nM siRNA（miR-940 mimic或 miR-940 inhibitor） 和 50 μl InvitrogenTMLipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑加入到鋪板的細(xì)胞中，分別為miR-940過(guò)表達(dá)組、miR-940敲減組，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組；轉(zhuǎn)染48 h。采用插入式Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室（0.4 μm孔徑的6孔板）構(gòu)建PCa-hMSC共培養(yǎng)體系，經(jīng)轉(zhuǎn)染的PC-3細(xì)胞以2.5×104個(gè)/孔接種于上室，hMSC 以 5×104個(gè)/孔接種于下室，共培養(yǎng)72 h后檢測(cè)細(xì)胞外泌體成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)；共培養(yǎng)28 d后去除培養(yǎng)基，hMSC經(jīng)PBS漂洗后加入4%多聚甲醛固定，行Von Kossa染色。

1.7 成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè) 采用RTPCR法，實(shí)驗(yàn)步驟同1.5。成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因包括 ALP、骨鈣素（bone gamma carboxyglutamate protein，BGLAP）等。

1.8 礦化面積占比檢測(cè) 采用Von Kossa染色。固定后的hMSC加入適量5%硝酸銀染色液覆蓋細(xì)胞表面，在紫外線直射60 min或直至肉眼可見(jiàn)黑色，去除染色液，蒸餾水漂洗數(shù)次；加入5%硫代硫酸鈉溶液孵育2～3 min平衡定影，再次漂洗，行核固紅復(fù)染5 min；在光學(xué)顯微鏡下觀察黑色的鈣沉積細(xì)胞（陽(yáng)性細(xì)胞）區(qū)域，即礦化面積；計(jì)算礦化面積占比，公式為陽(yáng)性細(xì)胞面積/總細(xì)胞面積×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCa骨轉(zhuǎn)移患者與正常老年男性血清外泌體中miRNA表達(dá)比較 與正常老年男性比較，PCa骨轉(zhuǎn)移患者血清外泌體中多個(gè)miRNA表達(dá)明顯升高，其中miR-940尤為明顯，見(jiàn)圖1（插頁(yè)）；同時(shí)在Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)中得到進(jìn)一步驗(yàn)證，見(jiàn)圖2。

圖1 PCa骨轉(zhuǎn)移患者與正常老年男性血清外泌體miRNA表達(dá)譜（PCa為前列腺癌，miRNA為微小RNA；A、B、C為PCa骨轉(zhuǎn)移患者；D、E、F為正常老年男性）

圖2 Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)中前列腺癌（PCa）組織與正常前列腺組織miR-940表達(dá)比較

2.2 PC-3細(xì)胞外泌體形態(tài)觀察及標(biāo)志性蛋白表達(dá)在電鏡下，PC-3細(xì)胞外泌體呈40～100 nm的盤狀囊泡，見(jiàn)圖 3a；外泌體標(biāo)志性蛋白 VDAC、CD63、Hsp70、CD81表達(dá)均明顯上調(diào)，見(jiàn)圖3b。

圖3 電鏡下PC-3細(xì)胞外泌體形態(tài)觀察及標(biāo)志性蛋白表達(dá)（a：電鏡下所見(jiàn)，×10 000；b：標(biāo)志性蛋白表達(dá)的電泳圖）

2.3 PC-3細(xì)胞與RWPE-1細(xì)胞外泌體中miR-940表達(dá)比較 PC-3細(xì)胞外泌體中miR-940表達(dá)明顯高于RWPE-1細(xì)胞外泌體，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 PC-3細(xì)胞與RWPE-1細(xì)胞外泌體中miR-940表達(dá)比較（與PC-3細(xì)胞外泌體比較，*P＜0.05）

2.4 PCa細(xì)胞外泌體miR-940過(guò)表達(dá)對(duì)骨轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的影響 在PCa-hMSC共培養(yǎng)體系中，miR-940過(guò)表達(dá)組ALP、BGLAP基因表達(dá)及礦化面積占比較miR-940敲減組、空白對(duì)照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖 5a-d（插頁(yè)）。

圖5 PCa細(xì)胞外泌體miR-940過(guò)表達(dá)對(duì)骨轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的影響（PCa為前列腺癌，BGLAP為骨鈣素；a：ALP基因表達(dá)比較，與miR-940過(guò)表達(dá)組比較，*P＜0.05；b：BGLAP基因表達(dá)比較，與miR-940過(guò)表達(dá)組比較，*P＜0.05；c：礦化面積占比比較，與miR-940過(guò)表達(dá)組比較，*P＜0.05；d：Von Kossa染色所見(jiàn)，×100）

3 討論

大部分PCa患者會(huì)發(fā)生成骨細(xì)胞型骨轉(zhuǎn)移。分子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能是預(yù)防或治療成骨細(xì)胞型骨轉(zhuǎn)移的潛在靶標(biāo)。關(guān)于PCa與骨骼之間溝通的介體，目前有研究提出了多種機(jī)制[18]。例如PCa通過(guò)旁分泌的方式，使可溶性蛋白與骨骼之間產(chǎn)生相互作用，從而誘導(dǎo)溶骨或成骨細(xì)胞活性，進(jìn)而導(dǎo)致骨骼重塑，影響PCa轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)的骨基質(zhì)[19]。另有研究表明，骨髓能釋放基質(zhì)衍生因子-1，增強(qiáng)PCa細(xì)胞到骨髓的轉(zhuǎn)移[20]。癌細(xì)胞分泌的miRNA可以修飾腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[21]。而它通過(guò)外泌體在細(xì)胞間進(jìn)行傳遞，從而影響受體細(xì)胞的表型[22]。研究表明，外泌體可以將生物分子（如蛋白質(zhì)、miRNA和mRNA等）轉(zhuǎn)移到不同的細(xì)胞[23]，其中來(lái)自原發(fā)腫瘤的外泌體可增強(qiáng)轉(zhuǎn)移。有證據(jù)顯示，原發(fā)性黑色素瘤的外泌體通過(guò)增加基質(zhì)細(xì)胞中MET癌基因的表達(dá)來(lái)培育骨髓間質(zhì)，從而促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移[24]。因此，本文就PCa來(lái)源外泌體在骨轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中的作用進(jìn)行探討。

目前關(guān)于PCa細(xì)胞釋放的外泌體攜帶何種特異性的miRNA信息，其能否通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)移前微環(huán)境介導(dǎo)骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展鮮有報(bào)道。本研究首先通過(guò)正常老年男性及PCa骨轉(zhuǎn)移患者血清外泌體miRNA表達(dá)譜，結(jié)合Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)中既往報(bào)道參與調(diào)控PCa侵襲轉(zhuǎn)移的miRNA研究，篩選出了存在顯著表達(dá)差異的外泌體miR-940。然后通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)比較了PCa細(xì)胞株P(guān)C-3與正常前列腺上皮細(xì)胞株RWPE-1外泌體中miR-940表達(dá)；再轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞并建立PCa-hMSC共培養(yǎng)體系，觀察了PCa細(xì)胞外泌體miR-940過(guò)表達(dá)對(duì)骨轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的影響。本研究結(jié)果顯示，PC-3細(xì)胞外泌體中miR-940表達(dá)明顯高于RWPE-1細(xì)胞外泌體；在PCahMSC共培養(yǎng)體系中，miR-940過(guò)表達(dá)組ALP、BGLAP基因表達(dá)及礦化面積占比較miR-940敲減組、空白對(duì)照組均明顯降低；這提示PCa細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-940有望成為逆轉(zhuǎn)骨轉(zhuǎn)移前微環(huán)境重構(gòu)、抑制PCa骨轉(zhuǎn)移形成的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，外泌體miR-940可以有效抑制PCahMSC成骨分化，這為轉(zhuǎn)移性PCa個(gè)體化治療提供了新的靶點(diǎn)。但是其調(diào)控PCa骨轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的分子機(jī)制尚未研究，筆者將進(jìn)一步篩選出存在潛在調(diào)控的基因，驗(yàn)證miR-940與候選靶基因是否存在直接的靶向關(guān)系，探討具體調(diào)控機(jī)制。