王彥彬 李瑞鵬 樓揚(yáng)鋒 楊龍飛 季澤益 宋晨

中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷導(dǎo)致的膀胱功能障礙稱為神經(jīng)源性膀胱[1]，臨床表現(xiàn)為膀胱高壓、尿失禁、反復(fù)尿流感染、腎積水、尿毒癥等，治療相當(dāng)棘手，是迄今尚未解決的醫(yī)學(xué)難題。近年來(lái)，隨著神經(jīng)泌尿領(lǐng)域的快速發(fā)展，骶神經(jīng)根磁刺激技術(shù)作為一種非侵入性、無(wú)創(chuàng)的神經(jīng)刺激系統(tǒng)的新技術(shù)，顯示出良好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備大鼠神經(jīng)源性膀胱模型，觀察骶神經(jīng)根磁刺激對(duì)脊髓損傷后膀胱尿流動(dòng)力學(xué)及膀胱逼尿肌組織中M3受體表達(dá)的影響，探討潛在的機(jī)制，以期為解決臨床難題提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性成年SD大鼠60只，購(gòu)自上海斯萊克[合格證號(hào)：SCXK（滬）：2017-004]。

1.2 動(dòng)物分組與處理 按隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為3組：正常組、模型組、磁刺激組，每組20只。除正常組（不作任何處理）外，其余兩組采用脊髓橫斷切除法建立神經(jīng)源性膀胱動(dòng)物模型[2]：大鼠腹部皮下注射2%戊巴比妥鈉作麻醉處理，四肢外展固定于實(shí)驗(yàn)?zāi)景迳?，剃毛，常?guī)消毒。依次切開(kāi)大鼠背部皮膚及皮下組織，沿棘突縱行劈開(kāi)大鼠雙側(cè)豎棘肌，在T9節(jié)段切除脊髓組織，清除損傷腔內(nèi)殘留的淤血及神經(jīng)組織，后逐層縫合傷口，消毒，模型構(gòu)建完畢。每只大鼠單籠飼養(yǎng)，初期采用腹部按壓方式輔助排尿。磁刺激組大鼠造模成功1 d后給予第1次骶神經(jīng)根磁刺激治療：使用武漢依瑞德公司生產(chǎn)的磁刺激儀，將圓型線圈放置在大鼠骶骨處，磁刺激儀連接電源，頻率設(shè)置為0.5 Hz，以大鼠骶部和（或）尾部顫動(dòng)而不致全身顫動(dòng)的表現(xiàn)為宜，給予1次/d，每次30個(gè)刺激沖動(dòng)，每個(gè)刺激沖動(dòng)間隔2 min，連續(xù)治療8周。模型組將圓型線圈放置在大鼠骶骨處，但不連接電源，不進(jìn)行磁刺激。3組大鼠均常規(guī)飼養(yǎng)。在建模及治療期間，模型組死亡4只，磁刺激組死亡5只，最終正常組、模型組、磁刺激組分別有20、16、15只大鼠完成實(shí)驗(yàn)。治療結(jié)束后，麻醉大鼠行膀胱尿流動(dòng)力學(xué)測(cè)定，處死大鼠取膀胱逼尿肌組織行HE染色和超微結(jié)構(gòu)觀察，同時(shí)檢測(cè)膀胱逼尿肌組織中M3受體表達(dá)水平。

1.3 膀胱尿流動(dòng)力學(xué)測(cè)定 乙醚麻醉大鼠，插入F2測(cè)壓導(dǎo)管至膀胱，與尿動(dòng)力學(xué)測(cè)壓管連接，調(diào)零后用微量灌注泵以2 ml/h速率灌注0.9%氯化鈉溶液[3]。記錄膀胱最大容量、膀胱漏尿點(diǎn)壓力、膀胱順應(yīng)性等尿流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。其中膀胱最大容量為當(dāng)出現(xiàn)尿道口連續(xù)漏尿時(shí)膀胱的總灌注量；膀胱順應(yīng)性=灌注量/漏尿點(diǎn)壓力。

1.4 膀胱逼尿肌組織學(xué)觀察 采用HE染色法。切取大鼠膀胱全層組織，10%甲醛固定、石蠟包埋、切片，置于68℃烤箱烤片1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇（濃度從高到低）脫水，流水沖洗數(shù)分鐘，蘇木素染色0.5 h，流水返藍(lán)數(shù)分鐘，伊紅染色5 s，梯度乙醇（濃度從低到高）脫水，二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片，在光鏡下觀察。

1.5 膀胱逼尿肌超微結(jié)構(gòu)觀察 取大鼠膀胱逼尿肌組織（約1 mm×1 mm×1 mm），置于4%戊二醛溶液低溫固定、石蠟包埋、預(yù)切片（厚4～6 mm），鋨酸染色定位后進(jìn)行超薄切片（厚0.1 μm），在透射電鏡下觀察。

1.6 膀胱逼尿肌組織中M3受體表達(dá)水平檢測(cè) 采用免疫組化SP法（免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）。取大鼠膀胱逼尿肌組織，石蠟包埋、切片、脫蠟、梯度乙醇水化，3% H2O2、37℃孵育，PBS沖洗，枸櫞酸鈉高溫高壓抗原修復(fù)3 min后自然冷卻；山羊血清封閉10 min后，傾去血清，滴加一抗（兔抗M3R受體）室溫孵育1 h，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，PBS洗滌5 min×3次，滴加兔型二抗，室溫孵育0.5 h，PBS沖洗5 min×3次，行DAB顯色，在光鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。使用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，利用Image pro-plus 6.0軟件計(jì)算平均吸光度（A值），即大鼠膀胱逼尿肌組織中M3受體表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠膀胱尿流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 3組大鼠膀胱最大容量、漏尿點(diǎn)壓力、膀胱順應(yīng)性等尿流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中磁刺激組膀胱最大容量、膀胱順應(yīng)性均高于模型組（均P＜0.05），漏尿點(diǎn)壓力低于模型組（P＜0.05）；而磁刺激組與正常組上述3個(gè)參數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表 1。

表1 3組大鼠膀胱尿流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

2.2 3組大鼠膀胱逼尿肌HE染色結(jié)果觀察 正常組大鼠膀胱逼尿肌纖維排列整齊，細(xì)胞未見(jiàn)明顯增大，未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖 1a（插頁(yè)）；模型組大鼠膀胱壁結(jié)構(gòu)不清，未見(jiàn)黏膜上皮，壁內(nèi)大部分區(qū)域高度充血、出血，水腫，且壁內(nèi)有少量壞死的肌纖維平行排列，并有輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1b（插頁(yè)）；磁刺激組大鼠膀胱黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)及排列接近正常組，局部細(xì)胞排列紊亂，肌層水腫，有輕度單個(gè)核炎細(xì)胞浸潤(rùn)，漿膜面增厚，漿膜下組織中度充血、水腫，有輕度單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，并有少量成纖維細(xì)胞增生，見(jiàn)圖1c（插頁(yè)）。

2.3 3組大鼠膀胱逼尿肌超微結(jié)構(gòu)比較 正常組大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞間隙較窄，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，見(jiàn)圖2a；模型組大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞大小不一致，細(xì)胞間隙變寬，分布錯(cuò)亂，部分細(xì)胞線粒體腫脹破裂且呈空泡狀，細(xì)胞連接纖維化、排列紊亂，見(jiàn)圖2b；磁刺激組大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞表面平滑，細(xì)胞間隙稍寬，排列尚均勻，胞質(zhì)內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)較完整，無(wú)腫脹破裂現(xiàn)象，見(jiàn)圖2c。

2.4 3組大鼠膀胱逼尿肌組織中M3受體表達(dá)水平比較 3組大鼠膀胱逼尿肌組織中M3受體表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中磁刺激組明顯高于正常組、模型組（均P＜0.05）；模型組與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2和圖3（插頁(yè)）。

圖1 3組大鼠膀胱逼尿肌組織學(xué)觀察所見(jiàn)（a：正常組；b：模型組；c：磁刺激組；HE染色，×400）

圖2 3組大鼠膀胱逼尿肌超微結(jié)構(gòu)比較（a：正常組；b：模型組；c：磁刺激組；×10 000）

圖3 3組大鼠膀胱逼尿肌組織中M3受體陽(yáng)性表達(dá)檢測(cè)所見(jiàn)（a：正常組；b：模型組；c：磁刺激組；免疫組化SP法，×400）

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷導(dǎo)致的膀胱功能障礙稱為神經(jīng)源性膀胱[1]，這類疾病在脊髓損傷患者中較為多見(jiàn)[4]，常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)有尿頻、排尿費(fèi)力、尿失禁、反復(fù)尿路感染等，嚴(yán)重者可出現(xiàn)腎積水、腎功能衰竭。因此，盡早干預(yù)治療十分重要。目前臨床上采取的治療方法主要有留置尿管、藥物治療、手術(shù)治療、骶神經(jīng)調(diào)控等[5]，但各自都有一些弊端。比如留置尿管或自我清潔導(dǎo)尿需要患者自行操作，若操作不當(dāng)，極易引發(fā)下尿路感染；而藥物治療作用進(jìn)展緩慢或效果欠佳；手術(shù)治療后需要長(zhǎng)期帶管生活，對(duì)患者造成極大不便。骶神經(jīng)調(diào)控是一種微創(chuàng)可逆的治療方法[6]，能取得一定的治療效果，但也存在有創(chuàng)治療、設(shè)備昂貴、易引發(fā)感染、病情反復(fù)等問(wèn)題，因此限制了其大規(guī)模開(kāi)展。

骶神經(jīng)根磁刺激是一種電療法。證據(jù)表明，它具有與骶神經(jīng)電刺激相同的影響，可產(chǎn)生類似的電場(chǎng)，但磁刺激的阻抗更小，衰減更少[7-8]。另有研究表明，骶神經(jīng)根磁刺激既能促進(jìn)與抑制排尿相關(guān)物質(zhì)的釋放，也能起到改善膀胱排尿功能的作用[9-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，磁刺激組大鼠膀胱最大容量、膀胱順應(yīng)性均高于模型組，膀胱漏尿點(diǎn)壓力低于模型組。M3受體存在于膀胱逼尿肌細(xì)胞膜上，介導(dǎo)逼尿肌細(xì)胞收縮[11]。有學(xué)者在大鼠去神經(jīng)損傷模型中，發(fā)現(xiàn)M3受體表達(dá)水平明顯升高，可能與大鼠去神經(jīng)損傷后乙酰膽堿遞質(zhì)減少，逼尿肌收縮力下降，M3受體代償性上調(diào)以維持逼尿肌收縮功能有關(guān)[12-13]。在本實(shí)驗(yàn)中，磁刺激組HE染色可見(jiàn)漿膜下組織中度充血、水腫，有輕度單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，并有少量成纖維細(xì)胞增生，但黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)及排列較模型組接近正常；在透射電鏡下可見(jiàn)逼尿肌細(xì)胞表面平滑，細(xì)胞間隙稍寬，排列尚均勻，胞質(zhì)內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)較完整；而免疫組化結(jié)果顯示膀胱逼尿肌組織中M3受體表達(dá)水平較正常組和模型組明顯升高。

表2 3組大鼠膀胱逼尿肌組織中M3受體表達(dá)水平比較

綜上所述，骶神經(jīng)根磁刺激對(duì)神經(jīng)源性膀胱大鼠的膀胱功能有一定的改善作用，可能與膀胱逼尿肌組織中M3受體表達(dá)升高有關(guān)，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。