周海永 顏俊鋒 趙凡 郁建迪 胡海平 張春和

膀胱功能障礙是常見的泌尿外科疾病，主要臨床表現(xiàn)有尿頻、尿急、夜尿增多等儲尿期癥狀和尿液排空障礙等排尿期癥狀[1]，且多見于老年人群，嚴重影響其生活質量[2-3]。Rohrmann等[4]對 8 627名中老年（48～79歲）男性的臨床調查結果顯示，75.3%、22.0%、2.7%伴有輕、中、重度下尿路癥狀，且輕重程度與年齡呈正相關。以往研究顯示，下尿路結構的改變（梗阻）或神經(jīng)支配的病變是老年人排尿障礙的主要病因[5-8]。但在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，膀胱的衰老也是導致老年人下尿路癥狀的主要原因。Kimura等[9]認為衰老會使膀胱與尿道協(xié)同性下降，從而導致膀胱排空障礙。Mansfield等[10]發(fā)現(xiàn)老年大鼠膀胱組織中M3受體表達下調，進而導致膀胱收縮功能受損。有證據(jù)表明，具有正常結構及收縮功能的膀胱平滑肌對于維持膀胱儲尿與排尿功能至關重要[11]。本研究對老年SD大鼠膀胱排尿功能的變化及組織結構改變作一探討，并通過復制性衰老細胞模型從微觀層面探究衰老所致膀胱平滑肌細胞（bladder smooth muscle cell，BSMC）表型轉化。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性SPF級SD大鼠16只，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心提供。其中3月齡8只，24月齡8只。飼養(yǎng)條件：溫度（24±2）℃，濕度50%～70%，晝（燈光照明）、夜各12 h。每天添加飼料1次，換水2次，更換墊料2次。動物自由進食、飲水。

1.2 主要試劑 DMEM/F-12高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，F(xiàn)BS購自美國Natocor公司，胰酶蛋白購自美國Sigma公司，小鼠抗α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、肌間線蛋白（Desmin）、Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）、Ⅲ型膠原（CollagenⅢ）單克隆抗體、小鼠抗β-actin單克隆抗體、異硫氰酸熒光素標記的羊抗小鼠IgG和辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG均購自武漢博士德生物工程有限公司，RIPA裂解液購自碧云天公司。

1.3 大鼠膀胱排尿功能測定 采用膀胱穿刺測壓法，參照Saito等[12]檢測步驟：20%烏拉坦溶液（0.5 ml/100 g）腹腔注射麻醉后，沿下腹正中線切開皮膚和肌肉，暴露膀胱。用濕潤棉花稍加固定，眼科鑷子輕提膀胱，4.5號頭皮針頭在膀胱頂部刺一小洞，然后用1號線稍加固定針頭，與三通管的一路相連，另兩路分別連接壓力換能器和注射泵，0.9%氯化鈉溶液密閉整個系統(tǒng)。打開MedLab生物信號采集器，記錄基礎膀胱內壓，隨后開啟注射泵，按0.2 ml/min持續(xù)泵入0.9%氯化鈉溶液，并記錄壓力變化，繪制膀胱內壓曲線圖。排尿時停止泵入0.9%氯化鈉溶液，利用記錄儀得到膀胱最大排尿壓力（maximum voiding pressure，MVP），收集排尿量；待排尿結束后，使用注射器抽空殘余尿液，計算膀胱內殘余尿量（residual urine volume，RUV）、排尿率（voiding efficiency，VE）。

1.4 大鼠膀胱組織膠原纖維占比檢測 采用Masson染色法。膀胱排尿功能測定結束后立即處死大鼠，剪取膀胱組織，用預冷的0.9%氯化鈉溶液沖洗，浸泡于4%多聚甲醛保存。常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟至水。在載玻片上加1滴蘇木素染色液，常溫下染色7 min，蒸餾水沖掉染液。加1滴復合染色液，常溫下染色5 min，蒸餾水沖洗掉染液。加1滴磷鉬酸，常溫下染色1 min，蒸餾水沖洗掉染液。加1滴亮綠染色液，染色10 s后，蒸餾水沖洗。將載玻片放入60℃烤箱烘干，中性樹膠封片，在倒置顯微鏡下觀察。每張切片隨機選取5個視野，采用IPP 6.0計算機圖像分析系統(tǒng)測出每個視野膠原纖維所占的面積百分比，計算5個視野面積百分比的平均值，即該組織切片膠原纖維占比。

1.5 BSMC原代培養(yǎng) 采用酶消化法培養(yǎng)細胞[13]。選用8周齡SD大鼠，頸椎脫位法迅速處死，然后轉移至無菌超凈臺中，局部酒精消毒后迅速切取膀胱組織置于無菌培養(yǎng)皿中，4℃預冷的PBS沖洗2遍。利用無菌的棉簽剔除漿膜和內膜，留下平滑肌層。將平滑肌層浸沒在1 ml 0.25%胰酶蛋白中，37℃搖晃30 min。吸出胰酶蛋白并置于Ⅰ型膠原酶中，將平滑肌層剪碎至1 mm3大小，在0.125%Ⅰ型膠原酶中37℃消化3 h。細胞混懸液中加入含10%FBS的DMEM/F-12終止消化，1 000 r/min離心4 min，取沉淀物分別培養(yǎng)。

1.6 BSMC復制性衰老模型構建 連續(xù)培養(yǎng)BSMC，計算細胞代數(shù)[14]。細胞達到約80%的融合生長后進行傳代，以2 000～4 000個/cm2的密度鋪板。每次傳代時所鋪細胞數(shù)計為N0，當細胞再次生長融合達到約80%時收獲細胞并將此時細胞數(shù)記為NH，經(jīng)公式（細胞代數(shù)=3.32×logNH/N0）計算每一次傳代的細胞代數(shù)。通過細胞代數(shù)的累加計算得出細胞的實際代數(shù)。本實驗選擇第10、20、30、40 代的 BSMC 進行研究。

1.7 BSMC 中 α-SMA、Desmin、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達檢測 采用Western blot法。收集并裂解細胞，離心得到蛋白樣本上清液，加入適量的濃縮上樣緩沖液，100℃金屬浴加熱5 min，使蛋白充分變性。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（10%分離膠；80 V，30 min；120 V，90 min）分離后，濕法轉至 PVDF 膜（300 mA，80 min）。5%脫脂奶粉室溫搖床封閉1 h，分別加入一抗小鼠抗α-SMA、Desmin、CollagenⅠ、CollagenⅢ（1:200）和鼠抗β-actin（1:1 000）4 ℃搖床過夜，TBST洗滌 3×10 min，羊抗鼠二抗搖床室溫避光孵育1 h，TBST洗滌3×10 min，使用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進行檢測，通過灰度值計算蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同月齡大鼠膀胱排尿功能比較 膀胱內壓測定曲線顯示，3月齡組大鼠膀胱內壓隨膀胱容量增加穩(wěn)定上升，而24月齡組大鼠排尿前膀胱內壓波動明顯，提示膀胱穩(wěn)定性欠佳，見圖1a。與3月齡組比較，24月齡組大鼠RUV明顯升高，而VE、MVP均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1b。

圖1 不同月齡大鼠膀胱排尿功能比較（a：膀胱內壓測定曲線；b：壓力及容量變化定量分析，RUV為殘余尿量，VE為排尿率，MVP為最大排尿壓力；與3月齡組比較，*P＜0.05）

2.2 不同月齡大鼠膀胱組織膠原纖維占比比較 Masson染色可見，3月齡組大鼠逼尿肌排列整齊，膠原纖維較少，而24月齡組大鼠膀胱組織中逼尿肌纖維排列紊亂、松散，膠原纖維較多，見圖2a（插頁）；24月齡組大鼠膀胱組織膠原纖維占比明顯高于3月齡組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖 2b（插頁）。

圖2 不同月齡大鼠膀胱組織膠原纖維占比比較（a：大鼠膀胱組織Masson染色結果，×100，藍色所示為膠原沉積；b：定量分析，與3月齡組比較，*P＜0.05）

2.3 復制性衰老BSMC形態(tài)及蛋白表達變化 在倒置顯微鏡下觀察，隨著細胞代數(shù)的增長，細胞從原來的細長梭形變?yōu)閷挻蠡?，?SMA、Desmin表達明顯減少（均P＜0.05），但CollagenⅠ、CollagenⅢ表達明顯增加（均P＜0.05），提示細胞表型發(fā)生變化，見圖3。

3 討論

老年排尿功能障礙的病因是多因素的，包括膀胱壁纖維化、逼尿肌收縮力下降和尿道張力降低等[2]。本研究比較了3、24月齡大鼠膀胱功能的變化來探討衰老過程中膀胱功能的變化。在24月齡大鼠中，MVP及VE明顯降低，RUV明顯升高都是常見的現(xiàn)象，提示老年大鼠出現(xiàn)了排尿障礙、尿失禁等癥狀。因此，筆者認為本研究以24月齡大鼠作為研究衰老膀胱的模型是合適的。在針對下尿路癥狀患者的臨床研究中，學者發(fā)現(xiàn)隨著患者年齡的增加，膀胱收縮力及尿流率呈下降趨勢，在老年人群中RUV明顯升高[2，15-16]，但其潛在機制仍不清楚。因此，本研究設計動物實驗和體外細胞實驗進一步闡明衰老引起膀胱功能障礙的潛在機制。

圖3 復制性衰老膀胱平滑肌細胞（BSMC）形態(tài)及蛋白表達變化[a：第10、20、30、40代BSMC形態(tài)，×200；b：BSMC中α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、肌間線蛋白（Desmin）、Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）、Ⅲ型膠原（CollagenⅢ）蛋白表達的電泳圖；c：蛋白表達定量分析，與 PD10比較，*P＜0.05]

膀胱纖維化、逼尿肌收縮力下降及膀胱感覺異常是導致老年膀胱排尿功能障礙的可能原因之一[2]。研究發(fā)現(xiàn)，老年雄性Fischer/Brown-Norway大鼠膀胱排尿功能障礙伴隨著膀胱組織膠原沉積明顯增加[17]，但在老年C67BL/6小鼠膀胱組織中未見到明顯的膠原沉積[18]。本研究發(fā)現(xiàn)老年SD大鼠膀胱組織中膠原沉積明顯增加，可能會影響膀胱收縮力。正常情況下，膠原蛋白在膀胱組織中起著支持和保護的作用，同時避免在高壓情況下膀胱過度膨脹[19]。然而，過度的膠原沉積會影響膀胱正常收縮功能。Schueth等[20]研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，膀胱組織中膠原纖維與平滑肌細胞比例明顯增加。本實驗結果也提示24月齡組膠原纖維占比較3月齡組明顯增加。逼尿肌中膠原過多是膀胱纖維化的特征，在老年人中較為常見[21]。膀胱壁纖維化可導致老年排尿功能障礙，損害逼尿肌收縮力，甚至導致膀胱功能衰竭。有證據(jù)表明，膀胱血流減少和長期膀胱壓力負荷，可導致缺血、缺氧，進一步導致膀胱壁纖維化，使膀胱順應性及收縮力降低[2]。

BSMC在維持正常的膀胱排尿功能中至關重要[11]。它依據(jù)結構和功能的不同，可分為收縮型（分化型）和合成型（分泌型或去分化型）2種表型。正常的BSMC多數(shù)為收縮型，通過特異性表達收縮蛋白和骨架蛋白來維持膀胱的舒張和收縮功能[22]。但在一定條件下，BSMC可由收縮型向合成型轉化，稱之為表型轉化，主要特征是合成型蛋白標志物（如 α-SMA、Desmin、CollagenⅠ、CollagenⅢ等）表達變化，同時伴有收縮能力下降，促炎因子、生長因子及細胞外基質等合成增加[23]。2001年，Burkhard等[24]報道了兔子膀胱出口梗阻模型中BSMC發(fā)生表型轉化。隨后，有學者在人和大鼠BSMC上證實了表型轉化的存在?，F(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病相關膀胱功能障礙大鼠BSMC模型和持續(xù)性張力負荷BSMC模型中存在細胞表型轉化現(xiàn)象，并證實其為膀胱功能障礙的重要病理基礎之一[25-27]。本實驗結果顯示，隨著細胞代數(shù)增長，BSMC形態(tài)由原來的細長梭形變?yōu)閷挻蠡危欢鞍追治鼋Y果顯示α-SMA、Desmin蛋白表達減少，提示細胞收縮力受損；CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達增加，提示衰老導致BSMC表型變化，可能促進膀胱纖維化的進程。

綜上所述，老年大鼠存在膀胱排尿功能減退及膠原比例失衡等，衰老所致BSMC表型轉化可能是其中的病理、生理機制之一。