蔣 萍 任 強 陳朝紅 諶達程 呂道遠 曾彩虹

冷球蛋白(cryoglobulin,CG)是在血清溫度<37℃時沉淀或形成凝膠，加熱復溫后再溶解的循環(huán)免疫球蛋白。目前診斷冷球蛋白血癥及相關疾病的主要診斷依據(jù)為血清冷球蛋白的定性定量檢測結果?；颊哐逶?℃保存至少7d，并在37℃時溶解，定量試驗含量>0.05 g/L時被認為冷球蛋白水平升高[1-4]。冷球蛋白血癥的臨床表現(xiàn)變異性較大，可表現(xiàn)為無癥狀到廣泛的多系統(tǒng)受累，包括皮膚損害，關節(jié)痛，周圍神經(jīng)病變，單個或多個器官的損害等[5-6]。

臨床工作中常因操作或者標本問題造成冷球蛋白檢測結果出現(xiàn)偏差，從而影響疾病診斷，因此迫切需要標準化冷球蛋白檢測[7]。在檢驗工作中，影響實驗結果的各項因素里，來自標本原因的占比為84.52%[8-9]。標本溶血在臨床較為常見，約占不合格標本的42.6%[10]。標本溶血時，紅細胞內(nèi)逸出的物質(zhì)會對檢測結果產(chǎn)生干擾，影響檢測結果的準確性，不利于指導臨床治療方案。目前國內(nèi)缺乏對冷球蛋白檢測的相關研究，本文擬觀察溶血對冷球蛋白檢驗結果的影響，以提高檢測結果的準確性。

對象與方法

研究對象納入2019年11月至2019年12月在東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院進行冷球蛋白檢測的20例患者血標本。排除標準：(1)基本信息缺失，如性別、年齡等；(2)不合格標本，如凝固不全、溶血。研究對象均知情同意。

實驗儀器37℃恒溫箱型號為BB-16(德國賀利氏),37℃標本水浴鍋型號為HH420(常州人和)，4℃冰箱型號為HYC—940(青島海爾)，高速可調(diào)溫離心機型號為SCR208A(日本日立)，紫外分光光度計型號為DU-730(美國貝克曼)。

檢測方法

標本采集 靜脈采集患者血液標本，平均置入2支試管，分別作為對照組和溶血組。

人工溶血 對照組：標本置于水浴鍋中保溫；溶血組：將血清析出后的標本從水浴鍋中取出迅速置于-70℃冰箱30 min后放回37℃水浴鍋中1h復溫。

分離血清 標本2 000 r/min 離心10 min，吸取上清置冰箱沉淀5～7d。

洗滌純化 4℃ 5 000 r/min離心15 min，棄上清，使用冷緩沖液洗滌3次，每次2 ml，渦流混懸，4℃下5 000 r/min離心5 min。

定量測定 3 mL溶解緩沖液溶解沉淀，測量280納米處光密度值(OD280)和260納米處光密度值(OD260)，利用公式：冷球蛋白數(shù)值=1 550×OD280-770×OD260，計算冷球蛋白數(shù)值。

統(tǒng)計學處理采用《SPSS 16.0》統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差表示。非正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)(四分位間距)表示。兩組間比較應用配對t檢驗，使用Pearson相關性系數(shù)分析差值與對照組的一致性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

患者一般資料20例患者納入本研究，其中男9例，女11例，年齡24～68歲，平均年齡(49.00±14.16)歲，尿蛋白定量3.31(0.4～10.62) g/24h，平均估算的腎小球濾過率(eGFR)73.65±31.52 ml/(min·1.73m2)，6/20例乙型肝炎病毒表面抗原陽性。入選人群疾病包括冷球蛋白血癥相關腎小球腎炎、膜增生性腎小球腎炎、紫癜性腎炎、乙肝相關性腎炎、狼瘡性腎炎、重鏈沉積病等。

兩組樣本檢測結果兩組冷球蛋白定量測定結果見表1，溶血組和對照組的冷球蛋白數(shù)值箱線圖見圖1，溶血組的中位數(shù)、Q3和Q1分別為246.63 mg/L、423.02 mg/L和163.81 mg/L，存在一個異常值(1 356.38 mg/L)，對照組的中位數(shù)、Q3和Q1分別為85.83 mg/L、188.765 mg/L和51.80 mg/L，存在兩個異常值(403.44 mg/L和411.33 mg/L)。溶血組的中位數(shù)明顯高于對照組，聚集性低于對照組。

表1 兩組吸光度值及冷球蛋白數(shù)值比較

圖1 兩組冷球蛋白數(shù)值箱線圖

組間差異性分析結果組間比較應用配對t檢驗，溶血組與對照組差異有統(tǒng)計學意義，溶血組結果高于對照組(t=4.453，P<0.01)。冷球蛋白數(shù)據(jù)均值增高了2.33倍。最大增高10.38倍，發(fā)生在第5例；最低增高了0.29倍，發(fā)生在第13例。

差值與對照組的一致性分析結果為了更好的分析數(shù)據(jù)關系，將差異率與對照組冷球蛋白數(shù)值進行趨勢分析(圖2)?？梢钥闯霎攲φ战M冷球蛋白數(shù)值<50 mg/L的時候，差異率呈現(xiàn)明顯增高的狀態(tài)，而在>50 mg/L時，差異率趨于穩(wěn)定，平均為134%。

圖2 對照組與差異率趨勢圖虛線為對照組數(shù)值>50 mg/L時的差異率平均值(134%)

使用Pearson相關性系數(shù)分析差值與對照組的一致性，整組的差值與對照組冷球蛋白數(shù)值呈中度相關性(r=0.56,P=0.01)，95%的一致性界線為(0.16，0.80)，剔除對照組中4例<50 mg/L的樣本數(shù)據(jù)后,差值與對照組冷球蛋白數(shù)值相關性較前者有所提升(r=0.64,P=0.01)，95%的一致性界線為(0.22，0.86)。

兩組數(shù)據(jù)回歸擬合結果為校正溶血對檢測值的影響，以推導出相對正確的數(shù)值，嘗試對溶血組和對照組冷球蛋白數(shù)值進行多項式擬合(圖3)。公式為y=-2×10-7x3+0.000 2x2+0.285 1x+16.972R2=0648 6

圖3 溶血組與對照組的多項式回歸

討 論

冷球蛋白相關性血管炎相對罕見，據(jù)估計發(fā)病率約為十萬分之一，常見于45～65歲患者。30%～60%的患者會累及腎臟，常出現(xiàn)在皮膚血管炎爆發(fā)期間或前后，可導致死亡率顯著升高[11]。冷球蛋白血癥相關腎小球腎炎常見病理類型為膜增生性腎小球腎炎[12]。本文所選樣本中冷球蛋白定量結果顯著增高的第4例和第12～14例腎活檢病理均為膜增生性腎小球腎炎，其中第13例被診斷為冷球蛋白血癥相關腎小球腎炎。

冷球蛋白相關性血管炎的診斷關鍵是冷球蛋白的檢測，而溶血是臨床生化實驗室最常見的分析前干擾因素，其發(fā)生率可高達3.3%，占所有不合格標本的40%～70%[13]。導致標本溶血的主要原因包括壓脈帶太緊或捆扎時間過長、皮膚消毒劑未干穿刺、穿刺過程中反復探查血管、真空采血管負壓過大、混勻用力過猛、標本環(huán)境溫度過高或過低，放置時間較長、運送途中劇烈振蕩等[14]。研究發(fā)現(xiàn)[15]，注射器壓力不均出現(xiàn)血液湍流更容易導致溶血。在預實驗中曾嘗試使用上述的相關溶血方式進行人工溶血[16-17]，最終從倫理和溶血效果方面綜合考慮，采用了溫度驟降來模擬體外溶血[18]。理論上冷球蛋白有低溫沉淀的特性，利用溫度驟降溶血可能會導致冷球蛋白沉淀流失，權衡好溶血和冷球蛋白流失是本實驗的難點，操作中利用增大驟降溫差來達到縮短驟降時間，并且充分復溫1h以上[7]盡量減少溶血組冷球蛋白流失，最終結果顯示溶血組數(shù)值在冷球蛋白可能少量流失的情況下依然高于對照組，所以溶血的干擾存在相對可靠。而在實際操作中非溫度驟降導致的溶血標本里，溶血干擾后的結果可能會更高，有待收集實際溶血標本做進一步探討。

溶血是指紅細胞發(fā)生破裂，血紅蛋白等紅細胞內(nèi)容物逸出進入血清的過程。實驗發(fā)現(xiàn)溶血組結果高于對照組，證實溶血會影響冷球蛋白檢測，導致檢測結果偏高，出現(xiàn)假陽性，影響臨床診斷。目前臨床上可通過傳統(tǒng)目測法(比對溶血比色卡)和儀器法判斷標本是否發(fā)生溶血,高志琪等提出，可以使用全自動分析前標本質(zhì)量核查系統(tǒng)，來提高不合格標本的檢出率,以輔助檢驗科的質(zhì)量管理[19]。當標本溶血導致血清中蛋白含量大量增加，經(jīng)過5～7d的低溫保存，蛋白可能會大量吸附在試管壁上或者與沉淀的冷球蛋白非特異結合導致不易洗脫從而影響實驗結果。如圖2所示，以對照組數(shù)值50 mg/L為界，在高于50 mg/L時，差異率趨于穩(wěn)定，平均為134%；低于50 mg/L時，差異率呈現(xiàn)明顯增加且較不穩(wěn)定，故此使用Pearson相關性系數(shù)分析了差值與對照組的一致性，在剔除了四對<50 mg/L的樣本組后，差值與對照組的一致性有所提升，呈現(xiàn)中度正相關性?？赡茉蚴侨苎獙е碌母蓴_蛋白會吸附試管壁或與沉淀的冷球蛋白非特異結合：當試管內(nèi)冷球蛋白很低時，干擾蛋白以吸附試管壁為主，結合不穩(wěn)定，在洗滌中容易被洗脫，且對照組分母小，因而呈現(xiàn)差異率不穩(wěn)定的現(xiàn)象；當冷球蛋白增多，干擾蛋白是以與沉淀的冷球蛋白非特異結合為主，依賴于冷球蛋白的量，差值與對照組呈現(xiàn)正相關性，而差異率亦趨于穩(wěn)定。因此可以嘗試通過適當增加洗滌次數(shù)和洗滌液體量，以清除吸附于試管壁的蛋白，洗滌過程充分渦輪震蕩將非特異結合蛋白洗脫，最終達到盡量減少溶血造成干擾的目的。

第13例被診斷為冷球蛋白血癥相關腎小球腎炎，其溶血組與對照組差值最小，需要在以后的研究中增加類似標本，進一步探討溶血對于冷球蛋白血癥相關腎小球腎炎的影響。文章將兩組數(shù)據(jù)進行回歸擬合，嘗試校正溶血對檢測值的影響，如圖3所示，多項式擬合的R2值較低，經(jīng)分析該擬合曲線應是多元非線性回歸問題，應將溶血程度作為需考慮的回歸因素之一。因此，考慮溶血程度的冷球蛋白多元回歸分析可作為未來研究方向。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)標本溶血可導致冷球蛋白定量檢測數(shù)值升高，升高程度與冷球蛋白含量存在一定相關性。為保證檢測結果的準確性，臨床工作中應在靜脈采樣、運輸、貯存和處理時嚴格按照標準化操作規(guī)程進行，盡量避免可能導致溶血的操作，從根本上減少溶血的發(fā)生。實驗室也應積極發(fā)現(xiàn)溶血標本，當實驗室發(fā)現(xiàn)溶血標本也應及時溝通，重新抽血。通過分析前質(zhì)量控制，可以為臨床提供準確有效的診斷依據(jù)。