曾雅妮 綜述 成梅初 審校

急性腎損傷(AKI)是重癥患者的常見并發(fā)癥，可導(dǎo)致患者死亡率和慢性腎臟病(CKD)的發(fā)生率增加。AKI可伴有細胞線粒體功能紊亂伴隨缺血缺氧，也是CKD的常見的原因之一，目前尚缺乏有效的治療方法來阻止CKD的進展。近年來有研究發(fā)現(xiàn)大量的特異性microRNA(miRNA)參與AKI的發(fā)病機制[1]。已有研究描述了不同AKI模型中線粒體損傷在腎臟疾病發(fā)展和進展中的致病作用[2-3]。本文擬對miRNA與AKI的發(fā)病和治療等關(guān)系進行綜述，重點探討miRNA在腎損傷中調(diào)節(jié)線粒體功能的可能機制，并討論其在AKI治療中的潛力。

miRNA參與線粒體活性氧(ROS)的產(chǎn)生與自噬

在腎缺血再灌注損傷(IRI)過程中，ROS的過量產(chǎn)生主要發(fā)生在再灌注早期，并在此后持續(xù)24 h，研究證明，腎近端小管細胞對缺血再灌注誘導(dǎo)的過量ROS引起的氧化應(yīng)激特別敏感，過量的ROS會損害線粒體，引發(fā)炎癥和凋亡，而線粒體又是細胞中ROS的主要來源[4]。Bai等[5]發(fā)現(xiàn)miR-335和miR-34a的過表達可通過抑制線粒中的超氧化物歧化酶2(SOD2)和硫氧還蛋白還原酶2(Txnrd2)誘導(dǎo)系膜細胞提前衰老，同時伴隨著ROS的增加，在該研究中，衰老腎臟固有細胞中上調(diào)的miRNA主要調(diào)控與能量代謝、細胞增殖、抗氧化防御和細胞外基質(zhì)降解相關(guān)的途徑或基因，而下調(diào)的miRNA主要針對與免疫炎癥反應(yīng)和細胞周期停滯相關(guān)的途徑或基因。在這一層面對于指導(dǎo)研究者對miRNA的表達譜進行篩選時有一定的意義。生理條件下，抗氧化基因產(chǎn)物在ROS的解毒中起主要作用。Cao等[6]發(fā)現(xiàn)miRNA200a-3p可激活腎小管細胞(TECs)中線粒體自身的抗氧化Keap1-Nrf2信號通路，減少ROS的產(chǎn)生防止線粒體碎裂。事實上，單個miRNA可以多個mRNAs為靶標，如 miR4270參與調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR、NOX5等表達，PI3K/AKT/mTOR與線粒體自噬有關(guān)[7]，NOX5是一種NAPH氧化酶，它的獨特功能與產(chǎn)生大量ROS有關(guān)[8]。而miR-145可通過調(diào)節(jié)LC3和Beclin 1及p62這三種自噬相關(guān)蛋白，從而抑制PI3K/AKT/mTOR的磷酸化，增加LC3B染色陽性和自噬體數(shù)量來達到保護腎臟細胞的目的[9]。LC3蛋白位于自噬體前體膜表面，有A和B兩種類型，當(dāng)自噬小體形成時，LC3A轉(zhuǎn)變?yōu)長C3B，LC3B通過與自噬小體表膜結(jié)合參與自噬溶酶體的形成。因此，LC3B染色陽性增加被認為是自噬增強[10]。

線粒體生物發(fā)生及代謝解偶聯(lián)

線粒體生物發(fā)生是增加細胞中線粒體質(zhì)量的過程[11]，包括兩種形式,第一種是裂變和融合形成新的線粒體，第二種是先前存在的線粒體的合成。后者主要在轉(zhuǎn)錄水平上被調(diào)節(jié),需要包括過氧化物酶體增殖物激活受體r共激活因子1α(PGC-1α)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)和核呼吸因子(NRF)在內(nèi)的主要調(diào)節(jié)因子的協(xié)同表達。在膿毒癥性AKI患者研究中，miR-142-5p，miR-191-5p，miR-3165，miR-4270和miR-23a-3p均與PGC-1α基因表達下調(diào)有關(guān)[12]，而PGC-1α的主要作用之一是激活線粒體生物發(fā)生和氧化磷酸化[13]。miR-23a-3p，miR-22-3p，miR-4456均參與調(diào)控PGC-1α上游基因sirt1的表達，sirt1作為線粒體動力學(xué)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,是一種位于線粒體基質(zhì)中激活PGC-1α的主要脫乙?；竅14]。線粒體是一種動態(tài)的細胞器，通過分裂和融合來維持其活性和功能，有研究表明miR-30抑制動態(tài)相關(guān)蛋白1(drp1)可以預(yù)防AKI[15]，敲除腎小管上皮細胞中的線粒體內(nèi)膜蛋白18(MTP18)能促進AKI的恢復(fù)和減輕纖維化[16]，這表明線粒體動力學(xué)的控制可能是一個潛在的治療靶點。線粒體動力學(xué)異常導(dǎo)致的線粒體斷裂是AKI及CKD(如糖尿病腎病)的重要原因之一[17]。Yu等[18]發(fā)現(xiàn)無論是體內(nèi)或體外的腎缺血模型都可誘導(dǎo)miRNA-214的表達，能抑制腎小管細胞表達絲裂霉素2(Mfn2，一種關(guān)鍵的線粒體融合蛋白)，而用miRNA-214抑制劑可以阻止腎小管近端細胞ATP耗竭后Mfn2的下調(diào),改善線粒體斷裂和凋亡。在缺血再灌注損傷中，缺氧誘導(dǎo)miRNA-668表達上調(diào)，它通過抑制MTP18以維持線粒體動力學(xué)和腎小管細胞的活力，并且miR-668的上調(diào)是腎小管上皮細胞在早期和亞急性階段的一種保護性反應(yīng)，這表示線粒體斷裂的抑制是一個早期事件，發(fā)生在再灌注15 min，并在亞急性損傷階段(12～24h)仍可檢測到且能持續(xù)到一定水平[19]。因此，miR-668是否可以進一步促進AKI的恢復(fù)和改善后續(xù)的纖維化值得深入研究。有研究者在順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠模型和人AKI腎組織的活檢樣本中檢測到近腎小管細胞(PTCs)中miR-709顯著上調(diào),而線粒體轉(zhuǎn)錄因子(TFAM)的基因修復(fù)可減輕順鉑或miR-709過表達所致的線粒體功能障礙和細胞損傷[20]，可見調(diào)節(jié)腎臟固有細胞中的TFAM可能成為抗miR-709誘導(dǎo)腎臟修復(fù)的機制，且這種干預(yù)不僅可增強線粒體生物發(fā)生，還可以減輕巨噬細胞誘導(dǎo)的炎癥、改善腎功能障礙程度、腎小管細胞壞死和凋亡。

解偶聯(lián)蛋白(UCPs)是線粒體內(nèi)膜上表達的一類線粒體陰離子載體蛋白，它將質(zhì)子從內(nèi)膜轉(zhuǎn)運到基質(zhì)中，從而導(dǎo)致內(nèi)膜電位的降低，減少電子傳遞鏈上的ROS釋放。當(dāng)發(fā)生AKI時，線粒體內(nèi)膜通透性改變，膜電位完全喪失，導(dǎo)致ROS的爆發(fā)。有研究者通過篩查全基因表達譜的方法確定了UCP1在腎小管中廣泛表達，是參與ROS的產(chǎn)生及細胞凋亡的調(diào)節(jié)因子，且它的轉(zhuǎn)錄也受PGC-1α的調(diào)控[21]。Leijiang等[22]發(fā)現(xiàn)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠模型的腎小管上皮細胞中線粒體解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的過度表達可導(dǎo)致腎纖維化，而miR-30E可直接靶向UCP2 mRNA促進巨噬細胞浸潤，腎小管細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和腎臟纖維化，Klinkhammer等[23]發(fā)現(xiàn)的潛在抗纖維化治療靶點轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和腎臟纖維化機制中也證實了miR-30E/UCP2軸具有重要作用(表1)。

表1 MicroRNA(miRNA)在急性腎損傷線粒體功能調(diào)節(jié)中的靶基因和作用

SOD:超氧化物歧化酶2；Txnrd：硫氧還蛋白還原酶；GPx：谷胱甘肽過氧化物酶；Catalase：過氧化氫酶；Keap1-Nrf2：Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1-核因子E2相關(guān)因子蛋白2信號通路；PGC-1α：過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α ；Sirt1：蛋白去乙酰激酶活性轉(zhuǎn)錄因子； VEGFA：血管內(nèi)皮生長因子A ；NOX5：尼科酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶5；WNT1：WNT 1蛋白；LC3Ⅱ：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；Beclin1：自噬Beclin 1蛋白；Mfn2：絲裂霉素2；MTP18：線粒體內(nèi)膜蛋白18 ；TFAM：線粒體轉(zhuǎn)錄因子；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子β1 ；UCP2：線粒體解偶聯(lián)蛋白2 ；Drp1：動態(tài)相關(guān)蛋白1

線粒體功能紊亂與AKI

引起腎臟疾病的觸發(fā)因素很多，主要包括糖尿病、 高血壓、 缺血性損傷、外源性有毒物質(zhì)、免疫復(fù)合物沉積、感染以及遺傳等。腎臟可通過適應(yīng)性修復(fù)和再生恢復(fù)其結(jié)構(gòu)和功能，但AKI患者的腎小管、血管、腎間質(zhì)的不完全性修復(fù)會加速腎臟的纖維化，從而導(dǎo)致CKD。AKI主要病理表型是腎小管損傷，線粒體作為具有各種重要功能的復(fù)雜細胞內(nèi)細胞器，TECs由于其重吸收功能而密集了大量線粒體，近端小管細胞中線粒體密度達29.2%[24]，這需要很高的能量消耗，而AKI時處于腎小管ATP耗竭狀態(tài)[25]，因此，TECs中的線粒體功能障礙被認為是AKI-CKD轉(zhuǎn)變的一種致病機制。同時，線粒體還具有一系列其他重要的功能，包括大分子的生物合成和細胞內(nèi)Ca2+信號的調(diào)節(jié)。此外，它們可能是腎小管細胞ROS產(chǎn)生的主要來源，也在激活細胞死亡途徑(凋亡和壞死)中起關(guān)鍵作用。腎損傷可能以不同的方式改變線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，同樣線粒體動態(tài)平衡的改變反過來促進腎臟損傷，引發(fā)有害的反饋循環(huán)導(dǎo)致CKD的發(fā)生[26]。腎臟中的ATP來源主要是通過FAO(線粒體脂肪酸β氧化)，線粒體功能障礙會導(dǎo)致ATP耗竭和脂毒性，從而引發(fā)腎小管損傷、炎癥和隨后的纖維化，最終進展為CKD[27]。有研究表明在AKI的狀態(tài)下線粒體DNA(MtDNA)的釋放誘導(dǎo)了免疫反應(yīng)和腎損傷進展，且在CKD患者的腎臟和小鼠腎纖維化模型中均發(fā)現(xiàn)TFAM顯著降低。TFAM是一種與MtDNA結(jié)合的必需蛋白，但其在AKI向CKD轉(zhuǎn)變中的作用機制尚不清楚[28]。Chung等[29]特異性地將小鼠的小管TFAM基因敲除后發(fā)現(xiàn)腎小管不僅出現(xiàn)嚴重的線粒體丟失，而且滲入胞質(zhì)的MtDNA作為激活環(huán)磷酸腺苷合成酶(CGAS)-干擾素基因刺激物(STINDNA)信號的關(guān)鍵機制，會促進巨噬細胞浸潤和腎臟纖維化。

miRNA調(diào)節(jié)線粒體功能保護腎臟機制

從機制上看，大多數(shù)研究將miRNA保護腎臟線粒體主要歸因于阻止靶基因mRNA的翻譯或誘導(dǎo)降解來調(diào)節(jié)基因表達，從而阻止缺血缺氧誘導(dǎo)的鈣超載、ROS的產(chǎn)生，線粒體動力學(xué)破壞及代謝解偶聯(lián)等一系列連鎖反應(yīng)[30]，這一系列反應(yīng)在腎臟缺血期間啟動，并且在再灌注后加劇累積[31]。調(diào)控細胞凋亡是腎臟自我保護的重要機制之一。最近的研究進展逐漸揭示了參與抗凋亡作用的特異miRNA及其靶點和信號通路(表1)，包括前文提到的Mfn2、MTP18等信號通路。自噬是miRNA參與腎臟保護的另一機制。在順鉑誘導(dǎo)的AKI模型中間充質(zhì)干細胞(MSCs)在體內(nèi)和體外均能增加自噬標志物和LC3II的表達，并與調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因(ATG-16L)表達有關(guān)[32]。另一組研究也表明，miRNA通過抑制mTOR信號通路增加了正常大鼠腎臟-52E(NRK-52E)細胞LC3B的表達以及ATG-5和ATG-7基因的表達[33]。前文也提到了針對PI3K/AKT/mTOR信號通路的miR-145增強了HK-2細胞LC3II和Beclin 1的表達。因此，在病理條件下，自噬作為細胞生存的適應(yīng)性和保護性機制也是腎臟保護的重要機制。其他機制還包括影響線粒體的生物發(fā)生。Drp1被認為是線粒體分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，上文提到了抑制Drp1表達的miR-30可以保護線粒體功能以及通過miRNA-214抑制劑阻止Mfn2下調(diào)能起到保護腎臟的作用。通過miRNA改善氧化應(yīng)激也是延緩腎臟AKI進展的一個重要機制。氧化應(yīng)激主要通過ROS的產(chǎn)生誘導(dǎo)AKI細胞凋亡、壞死和炎癥。在糖尿病腎病中，NADPH氧化酶(NOX5)作為ROS產(chǎn)生的誘導(dǎo)劑，隨著miR-485的治療而下降[34]。而miR-195-5p可能通過靶向血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)抑制氧化應(yīng)激及下調(diào)炎癥因子的表達來緩解AKI[35]。由此可見，miRNA通過各個方面參與了腎臟保護的調(diào)節(jié)機制,腎纖維化是CKD的病理過程，與腎功能障礙的進展密切相關(guān)。但開發(fā)miRNA療法目前最大挑戰(zhàn)之一是為每種疾病確定最佳的miRNA或miRNA靶點，當(dāng)然其他挑戰(zhàn)包括設(shè)計miRNA遞送載體，使候選治療藥物具有更高的穩(wěn)定性，實現(xiàn)組織特異性靶向以及如何避免潛在的毒性和靶外效應(yīng)等。其中miRNA可能在腎臟生理和病理的不同階段發(fā)揮不同的作用，在AKI中，腎臟微環(huán)境中的缺氧和炎癥等因素會導(dǎo)致復(fù)雜而動態(tài)的區(qū)域異質(zhì)性，臨床上腎活檢樣本只探測一個特定的區(qū)域，不能全面檢測miRNA的表達動態(tài)。為了克服這種障礙，需要研究者在疾病進展過程中對各種組織(理想情況下是在不同時間進行多次活檢)進行活檢樣本，以確定共同的調(diào)節(jié)miRNA。

小結(jié)：在AKI背景下進行miRNA調(diào)控是一個具有重要意義和前景的研究領(lǐng)域，在動物實驗取得的成果如能成功運用到臨床上，miRNA療法有可能使患者免于腎臟替代療法及其相關(guān)并發(fā)癥，AKI危重患者也能從中受益良多，達到阻止甚至逆轉(zhuǎn)疾病進程的目標。強大的人類生物學(xué)基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫有助于我們識別藥物開發(fā)的關(guān)鍵miRNA靶點，大數(shù)據(jù)的支持加上科學(xué)地分析，miRNA療法將顯示出巨大的臨床潛力。