陳雪芹 李博厚 張鳳霞 連智雯 蔣 楠 溫似春 吳 瓊 夏郁彬柯貴寶 張 鴻 鄺素娟 鄧春玉1，3， ，劉雙信

繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(SHPT)是血液透析(HD)患者的常見并發(fā)癥之一，增加了慢性腎臟病(CKD)患者的死亡率[1-2]。甲狀旁腺切除術(shù)(PTx)是治療重度SHPT重要措施之一，降低甲狀旁腺素(PTH)的同時，改善患者鈣磷代謝，降低血壓，甚至使正常血壓變?yōu)榈脱獕篬3]。但是低血壓容易造成透析患者血管通路血栓形成，動靜脈內(nèi)瘺閉塞，增加心血管病發(fā)病率和死亡率，影響患者的生存質(zhì)量[4-5]。但目前PTx降低血壓的機制尚不清楚。

早期在研究[6]自發(fā)性高血壓大鼠的甲狀旁腺中發(fā)現(xiàn)了COMM域蛋白5(COMMD5)。

COMMD5具有多種生物學(xué)功能：(1)COMMD5通過增加細胞周期長度和G2/M細胞周期積累，促進細胞的分化，抑制細胞增殖并促進自噬細胞死亡。 (2)COMMD5通過轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)自分泌環(huán)機制增加腎細胞遷移。 (3)COMMD5通過調(diào)節(jié)細胞增殖和遷移以及促進細胞再分化來加速缺血性損傷后的腎小管修復(fù)。 (4)COMMD5通過啟動子甲基化促進(ErbB)2/HER2的去磷酸化，充當(dāng)腎細胞癌的“抑癌基因”[7-8]。

COMMD5與血壓可能存在關(guān)聯(lián)，但在HD患者中，PTx降低血壓與COMMD5水平的關(guān)系尚未有文獻報道。因此，本研究擬通過臨床研究和實驗研究兩部分，分別探討HD患者PTx前后血壓變化和血清COMMD5變化水平的關(guān)系，以及內(nèi)皮細胞實驗檢測COMMD5是否影響心房利鈉肽(ANP)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS) 表達，旨在進一步探究甲狀旁腺切除對血壓影響的機制，為臨床治療PTx術(shù)后低血壓提供新的思路。

對象和方法

臨床研究研究對象共納入31例行PTx的HD患者。手術(shù)指征:(1)臨床癥狀明顯：骨痛、骨質(zhì)疏松、皮膚瘙癢，皮膚呈進展性鈣化等；(2)藥物治療無效的高血鈣、高血磷；(3)血清PTH>800 pg/ml；(4)超聲檢查或ECT提示甲狀旁腺增生。符合上述(1)～(3)中任意一項及(4)者。手術(shù)方式：甲狀旁腺全部切除(雙側(cè))+ 甲狀旁腺自體移植術(shù)。

觀察指標(biāo)比較患者PTx術(shù)前術(shù)后血壓、鈣、磷、鉀、PTH、COMMD5變化情況，收集患者術(shù)前PTx術(shù)前2天，術(shù)后3天的血清及血壓。

血清搜集清晨采集患者空腹靜脈采血5 ml，3 000 r/min離心10 min，取上清置于-80℃冰箱凍存, 以備后用。

血清檢測使用人含COMM域蛋白5(COMMD5)ELISA試劑盒，操作均按試劑盒說明書進行。

實驗研究

實驗試劑 DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(FBS)；0．05%胰酶(Gibco)；β-actin抗體(Abcam)；COMMD5抗體(NovoPro)；eNOS抗體(Abcam)；ANP抗體(ABclonal)；COMMD5重組蛋白(武漢華美);人含COMM域蛋白5(COMMD5)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物)。

細胞培養(yǎng) 肺微血管內(nèi)皮細胞(PMVEC)從中科院細胞庫購買,在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基、37℃含5%CO，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

實驗分組

COMMD5重組蛋白處理組 預(yù)實驗使用不同濃度的COMMD5重組蛋白(0、1 ng/ml、2 ng/ml、4 ng/ml、10 ng/ml)刺激血管內(nèi)皮細胞，根據(jù)COMMD5的濃度與內(nèi)皮細胞血管活性物質(zhì)釋放的量-效關(guān)系，最終選定在六孔板中(設(shè)復(fù)孔)，當(dāng)細胞融合達到70%～80%時，采用4 ng/ml的COMMD5重組蛋白干預(yù)細胞24h。

空白對照組(Con組) 加入與COMMD5蛋白等體積的DMEM培養(yǎng)基。

Western印跡細胞干預(yù)到時間后，每皿加入100 μl蛋白裂解液刮取蛋白，BCA法測得蛋白濃度后按照20∶ 1加入變性液，98℃變性10 min，按照每孔50 μg上樣蛋白，80V恒壓電泳分離后，200 mA恒流120 min濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%牛奶封閉1h，一抗4℃孵育過夜，用相應(yīng)二抗4℃孵育2h，用電化學(xué)發(fā)光液(ECL)曝光，Image J軟件分析灰度值。

統(tǒng)計學(xué)方法利用《SPSS 26.0》進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不符合正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示。符合正態(tài)分布的計量資料前后比較用配對T檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料前后比較用Wilcoxon秩和檢驗，相關(guān)性分析使用Pearson相關(guān)性分析。組間比較用Mann-Whitney U檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

甲狀旁腺切除對血壓和COMMD5的影響

患者的臨床情況 研究共納入31例行PTx的HD患者，平均年齡44.23±8.57(25～66)歲，男性17例，女性14例。中位透析齡為6(5～8)年；血清肌酐為(901.33±290.84)μmol/L。原發(fā)腎臟疾病分別為：慢性腎小球腎炎16例，高血壓腎病9例，糖尿病腎病3例，梗阻性腎病1例，多囊腎1例，其他病因1例。

PTx前后降壓藥使用情況 31例患者中，有11例患者未使用降壓藥物，7例患者使用1種降壓藥物，5例患者使用2聯(lián)降壓藥物，7例患者使用3聯(lián)降壓藥物，1例患者術(shù)前使用4聯(lián)降壓藥物控制血壓，所有患者在研究期間均未改變藥物的種類和劑量。

PTx前后血壓變化 患者PTx前收縮壓和舒張壓分別為(148.81±18.14)和(88.74±10.92) mmHg，術(shù)后分別為(140.58±20.55)和(75.48±12.83) mmHg。相較PTx前，患者術(shù)后收縮壓(P<0.05)、舒張壓(P<0.0001)下降(表1)。

PTx前后血清COMMD5變化 患者PTx術(shù)前血清COMMD5水平為0.65(0.43～1.07) ng/ml，術(shù)后為0.97(0.64～1.79) ng/ml。相較PTx術(shù)前，患者術(shù)后血清COMMD5水平升高(P=0.002)(表1)。

表1 血液透析患者PTx前后血壓、實驗室檢查數(shù)據(jù)比較

PTx前后血壓變化和COMMD5變化的相關(guān)性 患者PTx前后收縮壓變化水平(ΔSBP)與COMMD5變化水平(ΔCOMMD5)呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.57；P=0.000 7)，舒張壓變化水平(ΔDBP)與COMMD5變化水平(ΔCOMMD5)呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.36；P=0.043 6)(圖1)。

圖1 血液透析患者PTx前后血壓變化和COMMD5變化的相關(guān)性分析PTx：甲狀旁腺切除術(shù)；ΔSBP：PTx后SBP-PTx前SBP;ΔDBP：PTx后DBP-PTx前DBP;ΔCOMMD5:術(shù)后COMMD5-術(shù)前COMMD5；COMMD5:含COMM域蛋白5；使用Pearson相關(guān)分析；n=31;a:患者PTx前后收縮壓變化水平(ΔSBP)與COMMD5變化水平(ΔCOMMD5)呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.57;P=0.000 7);b:患者PTx前后舒張壓變化水平(ΔDBP)與COMMD5變化水平(ΔCOMMD5)呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.36;P=0.043 6)

COMMD5重組蛋白對血管內(nèi)皮細胞血管活性物質(zhì)表達的影響預(yù)實驗分別采用濃度為0、1 ng/ml、2 ng/ml、4 ng/ml、10 ng/ml的COMMD5重組蛋白刺激血管內(nèi)皮細胞24h，在COMMD5濃度為4 ng/ml時，ANP蛋白的相對表達量最高，eNOS蛋白表達量也在較高水平(圖2)。

圖2 COMMD5重組蛋白刺激對血管內(nèi)皮細胞血管活性物質(zhì)表達的量-效關(guān)系COMMD5：COMM域蛋白5;ANP:心房利鈉肽；eNOS:內(nèi)皮型一氧化氮合酶；A:COMMD5重組蛋白刺激對ANP表達量-效關(guān)系；B:COMMD5重組蛋白刺激對eNOS表達量-效關(guān)系；C：COMMD5重組蛋白刺激下，ANP和eNOS蛋白的表達

在COMMD5重組蛋白刺激24h后，Western印跡結(jié)果顯示血管內(nèi)皮細胞中ANP蛋白的表達量是 Con組的2.39倍，p=0.017 9；eNOS蛋白的表達量是 Con組的2.70倍，P=0.0005(圖3)。

圖3 COMMD5重組蛋白刺激下，血管內(nèi)皮細胞的eNOS與ANP蛋白表達增多COMMD5：COMM域蛋白5;ANP:心房利鈉肽；eNOS:內(nèi)皮型一氧化氮合酶；Con:空白對照組；A:COMMD5的蛋白水平關(guān)系；B:ANP的蛋白水平表達；C:eNOS的蛋白水平表達;*:與Con組相比，P<0.05;***:與Con組相比，P<0.01

討 論

在原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進患者[9-10]、血液透析患者[11-14]以及腎移植受者中[15-17]，PTx術(shù)后血壓均有不同程度的降低。但切除甲狀旁腺對血壓的調(diào)節(jié)機制尚不清楚。早期研究認為，PTx術(shù)后血鈣的減少和血壓降低之間有顯著的相關(guān)性，認為與PTx術(shù)后血管壁鈣外流有關(guān)[10-12]。本次研究結(jié)果顯示HD患者PTx術(shù)前術(shù)后血鈣的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，這與患者術(shù)后治療性補鈣有關(guān),每隔6h靜脈緩慢滴注1次10%葡萄糖酸鈣(10～80 ml)，4次/d，根據(jù)監(jiān)測的血鈣濃度調(diào)整補鈣量[18]。

文獻報道甲狀旁腺存在甲狀旁腺高血壓相關(guān)因子(parathyroid hypertensive factor，PHF)，但當(dāng)時未能克隆其基因及分離純化對應(yīng)蛋白[19]。直至2000年Solban等[6]根據(jù) PHF 的推定氨基酸序列在自發(fā)性高血壓大鼠的甲狀旁腺中克隆出高壓相關(guān)的鈣調(diào)節(jié)蛋白COMMD5。COMMD5含225個氨基酸質(zhì)，在細胞核表達,受細胞外的鈣負向調(diào)控, 甲狀旁腺細胞在低鈣刺激下，COMMD5呈高表達[20]。COMMD5 不僅在甲狀旁腺中高表達，在心臟、腎上腺及腎臟小管中也有高表達。

在過表達COMMD5 的人胚腎(HEK293)和 Madin-Darby 犬腎(MDCK)-C7 細胞系中，與對照相比，COMMD5 過表達細胞釋放出的ANP是對照的4.5～8倍[21]。ANP可使血管舒張，降低外周阻力，也可使心搏出量減少，減慢心率，減少心輸出量，從而降低血壓, 在血壓平衡中起著關(guān)鍵作用。在敲除ANP的小鼠中，血壓高于野生型小鼠52倍[22]。有研究在Na+限制性繼發(fā)性高血壓大鼠中，皮下注射ANP類似物(MANP)具有降低血壓的作用[23]。既往研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮上調(diào) COMMD5 及eNOS的水平，使 NO 水平增加[24]。eNOS是內(nèi)皮組織特異度蛋白，其代謝產(chǎn)物NO 激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶合成環(huán)磷酸鳥苷，從而發(fā)揮舒張血管,維持血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)的功能[25]。

本研究首次發(fā)現(xiàn)HD患者PTx后COMMD5血清水平升高，且患者PTx前后血壓變化和COMMD5變化呈顯著的負相關(guān)關(guān)系，提示PTx后血壓降低的發(fā)生可能除了PTH、鈣離子等傳統(tǒng)因素外，還跟 COMMD5血清水平升高有關(guān)。同時本研究驗證了COMMD5能夠上調(diào)ANP、eNOS表達，提示COMMD5可能與增強血管舒張功能相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)可能明確COMMD5對慢性腎臟病血壓的影響，為其治療提供新思路。

本研究發(fā)現(xiàn)在PTx后，血清COMMD5水平并沒有因為甲狀旁腺的切除降低，反而較術(shù)前升高，其升高的機制可能與PTH負調(diào)節(jié)COMMD5有關(guān)，PTx后低PTH使COMMD5在它器官組織中表達增加，具體機制還需進一步探討。本研究觀察時間較短,術(shù)后長期的血壓監(jiān)測對于透析時和透析間期的血壓管理更有臨床意義，我們將在以后的研究中延長隨訪時間。另外本文對COMMD5的研究，僅有體外實驗，暫未進行體內(nèi)的研究，后續(xù)我們將在SHPT大鼠模型中進一步探究。

小結(jié)：COMMD5與HD患者PTx術(shù)后血壓降低顯著相關(guān)，COMMD5可能通過上調(diào)ANP和eNOS調(diào)控血壓，其具體調(diào)控機制仍需今后進一步探討與研究。