吳學(xué)進(jìn) 劉春華 羅金輝 李春麗 馬晨 樂(lè)淵 吳南村

摘要：【目的】建立同步測(cè)定荔枝中甲哌啶、矮壯素等10種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（PGRs）殘留的QuEChERS凈化—超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），為荔枝中多種PGRs殘留同步檢測(cè)提供技術(shù)參考。【方法】荔枝樣品以1%（v/v）乙酸—乙腈提取，經(jīng)優(yōu)化QuEChERS前處理后，凈化后的樣品提取液以Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18柱為分離色譜柱，甲醇—5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸，v/v）緩沖溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，以UPLC-MS/MS在選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下對(duì)甲哌啶等10種PGRs目標(biāo)物殘留進(jìn)行測(cè)定?！窘Y(jié)果】在5～100 μg/kg范圍內(nèi)，10種PGRs質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積呈良好線性，相關(guān)系數(shù)（r2）均>0.9950;檢出限范圍為0.03～0.60 μg/kg。在10、25和100 μg/kg 3個(gè)添加水平范圍內(nèi)，平均回收率在71.8%～109.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.6%～10.0%。用優(yōu)化的QuEChERS凈化-UPLC-MS/MS對(duì)40份荔枝樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中1份樣品檢出多效唑，1份樣品檢出蕓苔素內(nèi)酯，PGRs檢出率為5.0%?！窘Y(jié)論】建立的QuEChERS凈化-UPLC-MS/MS簡(jiǎn)便、快速，具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，可用于同步測(cè)定甲哌啶等10種PGR在荔枝中的殘留。

關(guān)鍵詞： 荔枝;QuEChERS;植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（PGRs）;超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）

中圖分類號(hào)： S482.8? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）10-2532-08

Simultaneous determination of ten plant growth regulators residues in litchi by QuEChERS clean up-ultra high perfor-mance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

WU Xue-jin， LIU Chun-hua*， LUO Jin-hui， LI Chun-li， MA Chen， LE Yuan， WU Nan-cun

（Analysis and Testing Center， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Hainan Provincial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables， Haikou? 571101，China）

Abstract：【Objective】A method for simultaneous determination of ten plant growth regulators（PGRs） residues in litchi，such as meperidine，chlorpromazine and others，was developed by using ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS） in combination with QuEChERS methodology， to provide reference for simultaneous determination of multiple PGRs residue in litchi. 【Method】The litchi samples were extracted with acetonitrile containing 1%（v/v） acetic acid and purified by the optimized QuEChERS pretreatment method， then the purified sample extracting solutions were separated in Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 column with methanol-5 mmol/L ammonium acetate solution（containing 0.1% formic acid，v/v） as mobile phase by gradient program，and analyzed by using UPLC-MS/MS in selective reaction monitoring（SRM） mode for mepiquat chloride and other nine PGRs residues in samples. 【Result】The mass concentrations of ten PGRs showed good linearity with the corresponding peak area in the range of 5-100 μg/kg，and the correlation coefficient（r2） was more than 0.9950. The limits of detection（LODs） ranged from 0.03 to 0.60 μg/kg. The average recoveries at three spiked levels of 10，25，100 ?g/kg for all target compounds in the samples were in the range of 71.8%-109.2%，with relative standard deviations（RSD） between 0.6% and 10.0%. The optimized UPLC-MS/MS in combination with QuEChERS methodology mention above was used to detect 40 litchi samples，paclobutrazol was detected in one sample and so was brassinolide ，the detection rate of PGRs was 5.0%. 【Conclusion】The QuEChERS purofied-UPLC-MS/MS method is simple，rapid with high sensitivity and good repeatability， accuracy and precision， which can be used for simultaneous determination of ten PGR residues above mentioned in litchi.

Key words： litchi; QuEChERS; plant growth regulators（PGRs）; ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）

Foundation item： Major Project of National Agricultural Product Quality and Safety Risk Assessment（GJFP2019 013）;Basic Research Project of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences（1630082020009，1630082017001，1630082020002）

0 引言

【研究意義】荔枝（Litchi chinensis Sonn）是無(wú)患子科（Sapindaceae）荔枝屬（Litchi Sonn.）果樹(shù)，在我國(guó)有2000多年的種植記載歷史。荔枝果實(shí)口感鮮甜，營(yíng)養(yǎng)豐富，深得大眾青睞。荔枝作為大眾果盤的重要水果，其鮮果的產(chǎn)品質(zhì)量安全一直受到密切關(guān)注，但長(zhǎng)期以來(lái)人們更多關(guān)注于荔枝中的農(nóng)藥殘留（王運(yùn)儒等，2018），卻忽視了荔枝中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（Plant growth regulators，PGRs）的殘留。PGRs是化學(xué)合成與植物內(nèi)源激素有相似生理作用的一類物質(zhì)，能調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝過(guò)程，達(dá)到增產(chǎn)增效、改善品質(zhì)等目的，在現(xiàn)代高效農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。盡管大多數(shù)的PGRs在進(jìn)入植物體內(nèi)會(huì)隨著植物的新陳代謝而逐漸降解，具有高效、低毒、低殘留的特點(diǎn)，但濫用PGRs也會(huì)造成安全隱患，殘留的PGRs或其降解產(chǎn)物通過(guò)食物鏈積累和生物放大，會(huì)造成發(fā)育毒性，甚至可致畸、致癌、致突變等嚴(yán)重后果（馬晨等，2019;張新中等，2019）。目前我國(guó)對(duì)PGRs實(shí)行登記管理，有40多種在我國(guó)作物上登記使用（張宏軍等，2017），但GB 2763—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中僅規(guī)定了2，4-D、矮壯素、胺鮮脂、單氰胺、丁酰肼、多效唑、氟節(jié)胺、復(fù)硝酸鈉、甲哌鎓（助壯素）、抗倒酯、氯苯胺靈、氯吡脲、萘乙酸、噻苯隆、噻節(jié)因、四氯硝基苯、調(diào)環(huán)酸鈣、烯效唑、乙烯利和抑芽丹等20種PGRs殘留限量標(biāo)準(zhǔn)及配套的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn);S-誘抗素、超敏蛋白、三十烷醇、幾丁聚糖、氨基寡糖素和香菇多糖等6種PGRs因不存在安全風(fēng)險(xiǎn)，按照國(guó)際慣例列入豁免制定限量標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥名單，不需要制定殘留標(biāo)準(zhǔn);其他PGRs的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)還有待進(jìn)一步研究制定?？傮w上，我國(guó)PGRs殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的項(xiàng)目數(shù)量和覆蓋食品類別不足，對(duì)PGRs缺乏完整的控制標(biāo)準(zhǔn)，其相關(guān)的殘留檢測(cè)技術(shù)也在發(fā)展和完善中。因此，研究開(kāi)發(fā)快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)多組分PGRs在荔枝中殘留的方法，不僅可進(jìn)一步完善荔枝產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)，而且對(duì)于提高荔枝產(chǎn)品質(zhì)量安全、促進(jìn)荔枝產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，乃至保障人民群眾的食品安全均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前PGRs殘留的檢測(cè)方法有氣相色譜法（周艷明等，2010）、氣相色譜—質(zhì)譜法（張文華等，2016）、液相色譜法（胡曉科等，2018）和液相色譜—質(zhì)譜法（邱世婷等，2018）等。其中，氣相色譜法有時(shí)需對(duì)樣品進(jìn)行衍生反應(yīng)處理，步驟繁瑣，且易衍生不完全導(dǎo)致定量檢測(cè)不準(zhǔn)確;液相色譜法在檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)樣品時(shí)，存在基質(zhì)干擾及檢測(cè)的假陽(yáng)性現(xiàn)象;此外，氣相和液相在PGRs檢測(cè)過(guò)程中還存在確證性不足的缺陷，因此當(dāng)前PGRs殘留檢測(cè)多以色譜—串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為主（莫迎等，2019）。由于大部分PGRs極性大、不易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差，應(yīng)用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法具有樣品不需衍生化反應(yīng)、檢測(cè)靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，因而成為PGRs殘留檢測(cè)的優(yōu)選方法。QuEChERS樣品前處理方法是近年來(lái)國(guó)際上發(fā)展起來(lái)的一種用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的快速樣品前處理技術(shù)，該技術(shù)具有溶劑使用量少、污染小、成本低廉、操作簡(jiǎn)便、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于蔬菜水果基質(zhì)中多種農(nóng)藥殘留檢測(cè)的前處理（嚴(yán)煌倩等，2018）。目前已陸續(xù)有QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）同步測(cè)定多組分PGRs在水果殘留的報(bào)道。邱暑婷等（2017）采用乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）和無(wú)水硫酸鎂（MgSO4）作為QuEChERS前處理的凈化劑，建立了UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定葡萄中18種PGRs殘留的方法，該方法的平均回收率為71.0%～120.2%，定量限（LOQ）為0.56～8.70 μg/kg。夏虹等（2018）采用PSA、C18和MgSO4作為QuEChERS前處理的凈化劑，建立了測(cè)定柑橘中矮壯素等12種PGRs殘留的UPLC-MS/MS方法，其平均回收率為70.3%～109.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.9%～10.1%。樂(lè)淵等（2018a）采用C18和MgSO4作為QuEChERS前處理的凈化劑，建立了UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定蓮霧中氯吡脲等18種PGRs殘留的方法，該方法的平均回收率為71.0%～124%，RSD為0.6%～11.2%，定量限為0.30～5.0 μg/kg?？紫榧龋?019）采用PSA和MgSO4作為QuEChERS前處理的凈化劑，建立了蘋果中胺鮮酯殘留的氣相質(zhì)譜檢測(cè)方法，其評(píng)價(jià)平均回收率為74.1%～84.2%，RSD為1.5%～4.1%，定量限為8.0 μg/kg。【本研究切入點(diǎn)】盡管目前已有采用QuEChERS結(jié)合UPLC-MS/MS測(cè)定多組分PGRs在多種水果基質(zhì)中殘留的研究報(bào)道，但針對(duì)多組分PGRs在荔枝殘留的檢測(cè)尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)優(yōu)化MgSO4、PSA和C18等凈化材料組合，建立QuEChERS樣品前處理結(jié)合UPLC-MS/MS同步測(cè)定甲哌啶等10種PGRs在荔枝基質(zhì)中殘留快速檢測(cè)方法，為多組分PGRs在荔枝殘留檢測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及標(biāo)準(zhǔn)制定等相關(guān)食品質(zhì)量安全監(jiān)督工作提供參考依據(jù)，以促進(jìn)我國(guó)荔枝產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用荔枝樣品采自海南、廣東和廣西3省（區(qū)），共40份。矮壯素（Chlormequat chloride，CCC）、甲哌啶（Mepiquat chloride，DPC）、氯吡脲（Forchlorfenuron，CPPU）和噻苯?。═hidiazuron，TDZ）購(gòu)自美國(guó)Cato公司;胺鮮酯（Diethyl aminoethyl hexanoate，DA-6）、6-芐基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）、蕓苔素內(nèi)酯（Brassinolide，BR）、抑芽唑（Triapentheno）和抗倒酯（Trinexapac-ethyl）購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司;多效唑（Paclobutrazol，PP333，1000 mg/L）購(gòu)自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心。以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度均大于97%。甲醇、乙腈和甲酸（HPLC級(jí)）購(gòu)自美國(guó)Fisher公司;乙酸銨（HPLC級(jí)）購(gòu)自美國(guó)TEDIA公司;試驗(yàn)用水經(jīng)Milli-Q超純水系統(tǒng)制備;乙二胺—丙基硅烷（PSA，50～70 μm）購(gòu)自美國(guó)安捷倫公司;石墨化炭黑（GCB，50～120 μm）和碳十八吸附劑（C18，50 μm）購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司;氯化鈉（NaCl）和MgSO4（分析純）購(gòu)自廣州化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器設(shè)備：TSQ Quantum Access MAX超高壓液相—三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）;梅特勒AB-204N型電子天平（梅特勒—托利多儀器有限公司）;MS 3basic圓周振蕩器（德國(guó)IKA公司）;Eppendorf 5415R小型冷凍離心機(jī)（艾本德中國(guó)有限公司）;LXJ-Ⅱ型B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;TXW-80A微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別將甲哌啶等10種PGRs標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用于質(zhì)譜工作條件優(yōu)化;將該溶液置于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存（有效期7 d）。

溶劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：將甲哌啶等10種PGRs標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成質(zhì)量濃度為5、10、25、50和100 μg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)上機(jī)溶液，置于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存（有效期7 d）。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)上機(jī)溶液：將甲哌啶等10種PGRs標(biāo)準(zhǔn)品用空白荔枝基質(zhì)溶液配制成質(zhì)量濃度為5、10、25、50和100 μg/kg系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)上機(jī)溶液，置于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存（有效期7 d）。

1. 2. 2 樣品前處理 荔枝鮮果樣品取全果去核打碎勻漿，制成待測(cè)樣品，分裝于潔凈容器，置于-18 ℃冰箱中備用。

樣品提取：準(zhǔn)確稱取10.00 g樣品置于50 mL具塞離心管中，加入10.0 mL含1%（v/v）乙酸—乙腈溶液，加入2.0 g NaCl在MS 3basic圓周振蕩器于1800 r/min振蕩勻質(zhì)2 min;然后以4500 r/min離心3 min。

樣品凈化：取1.5 mL上清液置于2 mL QuEChERS分散凈化試劑管（內(nèi)含優(yōu)化確定后凈化材料組合），渦旋混勻1 min后于12000 r/min離心3 min;上清液用一次性注射器吸取，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，濾液按儀器優(yōu)化工作條件進(jìn)行測(cè)定。

1. 2. 3 儀器工作條件 UPLC條件：采用Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）色譜柱;柱溫35 ℃，樣品室溫35 ℃，進(jìn)樣體積2.0 μL，流速0.25 mL/min;流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸（v/v）水緩沖溶液，流動(dòng)相B為甲醇;梯度洗脫程序如表1所示。

ESI-MS/MS條件：采用電噴霧離子源（ESI），選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）掃描;離子化溫度350 ℃，離子傳輸管溫度320 ℃，離子化電壓+3200 V;鞘氣壓力45.0 Arb;輔助氣壓力8.0 Arb。10種PGRs的定量、定性離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量等其他具體參數(shù)見(jiàn)表2。

1. 2. 4 凈化方案設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)5種組合方案：①150 mg MgSO4+50 mg PSA;②150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18;③150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18+50 mg GCB;④150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18+25 mg GCB;⑤150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18+7.5 mg GCB，用以考察不同凈化材料組合對(duì)待測(cè)PGRs化合物回收率的影響。

取空白提取樣品，配制質(zhì)量濃度為0.50 μg/kg的上述10種PGRs基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)混合液，吸取1.5 mL混合標(biāo)準(zhǔn)液加入2 mL QuEChERS分散凈化試劑管（分別內(nèi)含上述5種不同凈化材料組合），渦旋混勻1 min后于12000 r/min離心3 min;上清液用一次性注射器吸取，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，濾液按儀器優(yōu)化工作條件進(jìn)行測(cè)定。每種凈化方案做6個(gè)平行樣品。通過(guò)考察其平均回收率評(píng)價(jià)不同方案的凈化效果，最終確定樣品的凈化方案。

1. 2. 5 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià) 以荔枝的空白基質(zhì)溶液和甲醇稀釋一系列相同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別計(jì)算基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值（胡勝杰等，2019），以比值評(píng)價(jià)其基質(zhì)效應(yīng)（ME）。ME按下式計(jì)算：

ME（%）=[kmatrixksolvent-1]×100

式中，kmatrix為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，ksolvent為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)ME>0時(shí)，表明基質(zhì)對(duì)待測(cè)物有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，ME<0為基質(zhì)抑制效應(yīng);若|ME|≤20%，表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯;若20%<|ME|≤50%，表明基質(zhì)效應(yīng)中等;若|ME|>50%，則表明基質(zhì)效應(yīng)很強(qiáng)（樂(lè)淵等，2018b）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 UPLC-MS/MS工作條件優(yōu)化結(jié)果

采用ESI，在正、負(fù)離子互切換監(jiān)測(cè)模式下，通過(guò)蠕動(dòng)泵將上述質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的10種PGRs單標(biāo)準(zhǔn)溶液以50 μL/min流速分別持續(xù)注入離子源，通過(guò)全掃描模式確定豐度較高且穩(wěn)定的母離子及對(duì)應(yīng)套管透鏡電壓值，而后進(jìn)一步優(yōu)化噴霧電壓、鞘氣壓力、輔助氣壓力等參數(shù)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)確定母離子給予一定的碰撞能量，做子離子碎片掃描，每個(gè)化合物選取2對(duì)豐度相對(duì)較高、干擾小的碎片離子分別作為定量和定性離子對(duì)。在10種PGRs中，6-芐基腺嘌呤、氯吡脲、噻苯隆和蕓苔素內(nèi)酯在正、負(fù)離子模式下均有響應(yīng)，但正離子模式下響應(yīng)值較高，最終10種PRGs均采用正離子模式掃描，其具體優(yōu)化條件見(jiàn)表2。圖1是標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度為100 μg/kg 10種PGRs的SRM色譜圖。

2. 2 色譜柱條件的考察選用

由于C18色譜柱對(duì)強(qiáng)極性化合物的保留性不佳，因此本研究選用極性較強(qiáng)的甲哌啶在色譜柱保留的峰形作為色譜柱選取的考察指標(biāo)，考察其在以下色譜柱：（a）Thermo Hypersil Gold C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）;（b）Waters Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;（c）Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）;（d）Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）;（e）Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）;（f）Agilent ZORBAX SB-Aq C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）的保留時(shí)間和峰形，結(jié)果見(jiàn)圖2。如圖所示，甲哌啶在6種色譜柱保留的時(shí)間分別為0.41、0.59、0.89、1.05、1.83和5.83 min，其中在前4種色譜柱的保留時(shí)間均小于或接近1.00 min，盡管在第6種色譜柱的保留時(shí)間為5.83 min，但其保留峰拖尾嚴(yán)重，也不適合選用;故最終選用Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18作為后續(xù)試驗(yàn)的分離柱。

2. 3 流動(dòng)相的考察選用

采用100 μg/L甲哌啶標(biāo)準(zhǔn)溶液為考察指示待測(cè)物，在不同的流動(dòng)相[①乙腈—水;②甲醇—水;③甲醇—水（含0.1%甲酸，v/v）]下，以甲哌啶在Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18的保留時(shí)間和響應(yīng)值作為選用流動(dòng)相的依據(jù)。如圖3所示，甲哌啶在①乙腈—水的保留時(shí)間為1.52 min，響應(yīng)值為1.93×106 AU，在②甲醇—水的保留時(shí)間為3.37 min，響應(yīng)值為1.12×106 AU，且峰形稍有拖尾，兩者響應(yīng)值均能滿足檢測(cè)需要，但從環(huán)保和成本角度考慮，優(yōu)選②甲醇—水。進(jìn)一步考察還發(fā)現(xiàn)，在②甲醇—水加入0.1%甲酸后，甲哌啶的保留時(shí)間為1.83 min，響應(yīng)值為7.24×105 AU，且峰形更尖銳對(duì)稱;在水相中加入5.0 mmol/L的乙酸銨后，甲哌啶的保留時(shí)間為1.83 min，但響應(yīng)值增至7.95×105 AU。根據(jù)目標(biāo)待測(cè)物的保留峰形和響應(yīng)值，最終確定甲醇—5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸，v/v）緩沖溶液體系作為后續(xù)試驗(yàn)的流動(dòng)相。

2. 4 凈化方案選擇結(jié)果

5種凈化方案的回收率見(jiàn)表3，結(jié)果表明，PSA和C18對(duì)氯吡脲等10種PGRs均無(wú)明顯吸附作用，但同時(shí)含有PSA和C18的方案②凈化效果比只含有PSA的方案①更佳，其回收率在86.5%～107.7%;GCB對(duì)氯吡脲、噻苯隆、6-芐基腺嘌呤和蕓苔素內(nèi)酯均有吸附，當(dāng)方案③的GCB用量為50 mg時(shí)，氯吡脲和噻苯隆的回收率分別為4.7%和6.1%，6-芐基腺嘌呤和蕓苔素內(nèi)酯的回收率分別為38.9%和34.2%;隨著GCB用量由50 mg降至25 mg，噻苯隆、6-芐基腺嘌呤和蕓苔素內(nèi)酯的回收率上升（方案④），當(dāng)GCB用量降至7.5 mg時(shí)，蕓苔素內(nèi)酯和6-芐基腺嘌呤的回收率分別達(dá)84.8%和68.7%，而噻苯隆和氯吡脲的回收率也達(dá)42.6%和35.6%（方案⑤）。由此可見(jiàn)，GCB對(duì)具有平面結(jié)構(gòu)的PGRs化合物有吸附作用，特別是對(duì)噻苯隆和氯吡脲具有強(qiáng)吸附效應(yīng)。綜上考慮，最終確定150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18（方案②）作為后續(xù)試驗(yàn)樣品凈化方案。

2. 5 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)結(jié)果

10種PGRs的基質(zhì)效應(yīng)分析結(jié)果見(jiàn)表4，6-芐基腺嘌呤的ME為438%，為顯著基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng);其余9種PGRs的|ME|≤20%，表明其基質(zhì)效應(yīng)不明顯。為校正基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高定量的準(zhǔn)確度和可靠性，采用基質(zhì)匹配外標(biāo)校準(zhǔn)曲線對(duì)樣品殘留的PGRs殘留進(jìn)行定量。

2. 6 方法的線性范圍、檢出限和定量限

經(jīng)優(yōu)化比較，最終確定QuEChERS凈化-UPLC-MS/MS為：儀器條件見(jiàn)1.2.3，選用Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18作為分離色譜柱;樣品前處理方法見(jiàn)1.2.2，其中提取液為1%（v/v）乙酸—乙腈溶液，樣品凈化材料為150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18。

以空白荔枝樣品凈化液配制成質(zhì)量濃度為5、10、25、50和100 μg/kg系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在經(jīng)優(yōu)化后確定的UPLC-MS/MS條件下進(jìn)行測(cè)定。以待測(cè)目標(biāo)化合物定量離子的峰面積y為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度x（μg/kg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得到10種PGRs的線性方程及相關(guān)系數(shù)（表4）。結(jié)果顯示，在質(zhì)量濃度為5～100 μg/kg范圍內(nèi)，10種PGRs校正曲線呈良好的線性，其相關(guān)系數(shù)（r2）>0.9950。

選擇較低濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，逐級(jí)稀釋上機(jī)檢測(cè)，分別以3倍信噪比（S/N≥3）計(jì)算上述方法的檢出限，以10倍信噪比（S/N≥10）計(jì)算該方法的定量限，結(jié)果見(jiàn)表4。氯吡脲等10種PGRs的檢出限在0.03～0.60 μg/kg，定量限在0.10～2.00 μg/kg。

2. 7 添加回收試驗(yàn)結(jié)果

在荔枝空白樣品添加濃度分別為10、25和100 μg/kg 3個(gè)水平，每個(gè)水平各6份（n=6），采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合外標(biāo)法定量，計(jì)算平均回收率和RSD，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，10種PGRs在10、25和100 μg/kg 3個(gè)水平的回收率為71.8%～109.2%，RSD為0.6%～10.0%，符合方法學(xué)要求。

2. 8 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

采用建立優(yōu)化后的QuEChERS凈化-UPLC-MS/MS測(cè)定采集于海南、廣東和廣西3?。▍^(qū)）荔枝樣品40份，共有2份樣品檢出PRGs，檢出率為5.0%;其中1份樣品檢出多效唑，殘留值為0.12 mg/kg，1份樣品檢出蕓苔素內(nèi)酯，殘留值為0.18 mg/kg。檢測(cè)結(jié)果表明當(dāng)前PGRs在荔枝的殘留現(xiàn)象存在，其安全隱患不容忽視。

3 討論

多組分PRGs殘留快速檢測(cè)方法的建立需要考慮兩方面：一是考察儀器對(duì)目標(biāo)待測(cè)物檢測(cè)的可行性和檢測(cè)條件的優(yōu)化，如胺鮮酯的分子結(jié)構(gòu)僅有1個(gè)羧基，羧基的吸收波長(zhǎng)多為100～200 nm，不具備產(chǎn)生紫外吸收的C=C共軛及苯環(huán)結(jié)構(gòu)，因此胺鮮酯不適合用HPLC—光電二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)（孔祥吉等，2019）;二是樣品的前處理環(huán)節(jié)。

本研究選取的10種PGRs在液相串聯(lián)質(zhì)譜是可行的，其儀器檢測(cè)的條件優(yōu)化包括質(zhì)譜參數(shù)、色譜柱和流動(dòng)相條件優(yōu)化選取。當(dāng)應(yīng)用不同液相—串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)相同目標(biāo)化合物時(shí)，在儀器最優(yōu)的條件下，目標(biāo)待測(cè)物的主要離子碎片大小和豐度差異不明顯，即其定性定量離子對(duì)質(zhì)量數(shù)差異不大，但所對(duì)應(yīng)的碰撞電壓和碰撞能量等質(zhì)譜儀參數(shù)因儀器不同會(huì)有所差異，應(yīng)以儀器具體優(yōu)化參數(shù)為準(zhǔn)，不能一概而論。因此，本研究?jī)?yōu)化所得10種PGRs的液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)的定量和定性離子對(duì)與邱世婷等（2018）的研究結(jié)果差異不大，但碰撞能量等具體儀器參數(shù)以本研究應(yīng)用的儀器優(yōu)化條件為準(zhǔn)。其次是由于不同色譜柱填料極性不同，目標(biāo)待測(cè)物在不同色譜柱的保留時(shí)間和峰形有所差異，多組分分析方法的建立需兼顧極性差異較大的各種化合物。C18色譜柱對(duì)極性強(qiáng)的化合物保留較差，極性較強(qiáng)的化合物在C18色譜柱出峰較快，甚至是在色譜柱的出峰“死時(shí)間”附近。因此，在色譜柱考察過(guò)程中，本研究選擇極性較強(qiáng)的甲哌啶保留狀況作為色譜柱選取的考察指標(biāo)，根據(jù)甲哌啶在6種色譜柱的保留時(shí)間，并綜合考慮待測(cè)物的峰形、響應(yīng)值和分離度，最終選用Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色譜柱作為后續(xù)試驗(yàn)的分離柱。另外，液相流動(dòng)相的組成不僅會(huì)影響目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和保留峰形，還會(huì)影響離子化效率，進(jìn)而影響檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性。經(jīng)考察，在乙腈—水和甲醇—水這2個(gè)流動(dòng)相體系中，10種PGRs待測(cè)化合物均具有良好的分離度和響應(yīng)值，從節(jié)約成本和環(huán)保角度考慮，優(yōu)選甲醇—水流動(dòng)相體系。進(jìn)一步考察發(fā)現(xiàn)，在甲醇—水中加入0.1%甲酸能有效改善目標(biāo)待測(cè)物的峰形;在水相中加入5.0 mmol/L乙酸銨后，化合物電離的效果得到改善，更能促進(jìn)目標(biāo)化合物的保留、分離及改善化合物保留峰形。因此最終確定甲醇—5.0 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸，v/v）緩沖溶液體系作為后續(xù)試驗(yàn)的流動(dòng)相。

樣品前處理是多組分農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法建立的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。PGRs在植物體內(nèi)經(jīng)代謝后殘留量較少，處于微量和痕量水平，且荔枝果肉含有大量的多糖、維生素、脂肪酸和黃酮醇類等干擾成分會(huì)使檢測(cè)靈敏度降低，影響目標(biāo)化合物檢測(cè)的準(zhǔn)確度，因此荔枝的提取液在儀器檢測(cè)前需進(jìn)行凈化處理。QuEChERS樣品前處理方法中常用MgSO4作為除水劑，用PSA、C18及GCB作為凈化材料。PSA可利用乙二胺-N-丙基官能團(tuán)極性作用和離子交換作用去除待測(cè)樣品中的有機(jī)酸、脂肪酸和糖分等干擾物質(zhì);C18具有非極性吸附作用，對(duì)樣品中所含有極性較弱的脂肪酸、烯烴類和甾醇類具有較好的吸附效果;GCB具有片層結(jié)構(gòu)，可去除葉綠素、類胡蘿卜素及固醇類雜質(zhì)，有很好的吸附效果，但同時(shí)對(duì)平面結(jié)構(gòu)特別是含有芳香環(huán)及對(duì)稱性結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥也具有較強(qiáng)的吸附作用，會(huì)導(dǎo)致部分具有平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥化合物的回收率偏低。凈化試驗(yàn)結(jié)果表明，PSA和C18 的用量均為50 mg時(shí)，對(duì)目標(biāo)待測(cè)物無(wú)吸附作用，但GCB用量為50 mg時(shí)，對(duì)氯吡脲、噻苯隆、6-芐基腺嘌呤和蕓苔素內(nèi)酯具有吸附作用，即使GCB用量降為7.5 mg時(shí)，對(duì)噻苯隆和氯吡脲仍存在吸附作用。因此，本研究只選用PSA和C18作為凈化材料，且3個(gè)添加水平的回收率也取得較好效果。

當(dāng)前，針對(duì)PGRs這一大類農(nóng)業(yè)生產(chǎn)化學(xué)投入品，我國(guó)在PGRs殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的項(xiàng)目數(shù)量和覆蓋食品類別不足，且相應(yīng)檢測(cè)技術(shù)方法標(biāo)準(zhǔn)不完善，難以滿足日趨嚴(yán)苛的殘留限量要求。如我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》僅規(guī)定多效唑在荔枝的殘留限量為0.5 mg/kg;對(duì)胺鮮酯、噻苯隆和抗倒酯僅在水果規(guī)定臨時(shí)限量值（未針對(duì)荔枝）;而對(duì)甲哌啶、矮壯素、氯比脲、6-芐基腺嘌呤、蕓苔素內(nèi)酯和抑芽唑未規(guī)定其在水果的殘留限量值。此外，在GB 2763—2019中目前尚未指定胺鮮酯的檢測(cè)方法;甲哌啶、矮壯素、6-芐基腺嘌呤、多效唑和抗倒酯這5種PGRs指定檢測(cè)方法GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法》規(guī)定其檢出限分別為0.23、0.03、17.7、0.14和17.67 μg/kg;甲哌啶、芐腺嘌呤和氯吡脲指定檢測(cè)方法GB/T 20770—2008《糧谷中486種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜》規(guī)定其檢出限分別為0.45、35.40和5.70 μg/kg;而矮壯素僅在糧油規(guī)定其殘留限量值，相應(yīng)指定檢測(cè)方法GB/T 5009.219—2008《糧谷中矮壯素殘留量的測(cè)定》規(guī)定矮壯素的檢出限為10 μg/kg。本研究建立的10種PGRs檢測(cè)方法的檢出限與GB 2763—2019中所指定的檢測(cè)方法相比較，其檢出限均符合相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)要求。

4 結(jié)論

通過(guò)優(yōu)化質(zhì)譜條件和色譜條件，考察不同流動(dòng)相和凈化材料，建立的QuEChERS凈化-UPLC-MS/MS簡(jiǎn)便、快速，具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，可用于同步測(cè)定甲哌啶等10種PGRs在荔枝中的殘留。

參考文獻(xiàn)：

胡勝杰，李優(yōu)，周瑩，伊雄海，鄧曉軍，陳沁，徐敦明，鈕冰. 2019. QuEChERS法結(jié)合液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定保健食品中50種非食用添加物[J]. 色譜，37（7）：701-711. [Hu S J，Li Y，Zhou Y，Yi X H，Deng X J，Chen Q，Xu D M，Niu B. 2019. Determination of 50 non-edible additives in health food using the QuEChERS method and liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography，37（7）：701-711.]

胡曉科，孫丹紅，文君，楊曉松. 2018. 熒光衍生-HPLC法檢測(cè)豆芽中苯氧乙酸類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留[J]. 分析試驗(yàn)室，37（11）：1320-1323. [Hu X K，Sun D H，Wen J，Yang X S. 2018. Determination of phenoxyacetic acid phytohormones residues based on fluorescence derivatization[J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory，37（11）：1320-1323.]

孔祥吉，孔順，張雪梅，孔德洋. 2019. 改進(jìn)QuEChERS-氣相色譜—質(zhì)譜法測(cè)定蘋果中胺鮮酯殘留[J]. 色譜，37（12）：1363-1367. [Kong X J，Kong S，Zhang X M，Kong D Y. 2019. Determination of diethyl aminoethyl hexanonate residues in apples by gas chromatography-mass spectro-metry combined with improved QuEChERS[J]. Chinese Journal of Chromatography，37（12）：1363-1367.]

樂(lè)淵，李春麗，張振山，吳南村，劉春華. 2018a. QuEChERS凈化—超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蓮霧中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào)，34（2）：234-238. [Le Y，Li C L，Zhang Z S，Wu N C，Liu C H. 2018a. Determination of plant growth regulators in wax apple using QuEChERS method coupled to ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Analytical Science，34（2）：234-238.]

樂(lè)淵，劉春華，張振山，李春麗. 2018b. 超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蓮霧中51種農(nóng)藥殘留量[J]. 理化檢驗(yàn)（化學(xué)分冊(cè)），54（10）：1129-1137. [Le Y，Liu C H，Zhang Z S，Li C L. 2018b. UPLC-MS/MS determination of 51 pesticide residues in Syzygium samarangense[J]. Physical Testing and Chemical Analysis（Part B：Chemical Analysis），54（10）：1129-1137.]

馬晨，張群，段云，張學(xué)強(qiáng)，張利強(qiáng). 2019. 荔枝上植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑使用與殘留現(xiàn)狀分析[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，39（4）：67-75. [Ma C，Zhang Q，Duan Y，Zhang X Q，Zhang L Q. 2019. Usage and residues of plant growth regulators on litchi[J]. Chinese Journal of Tropical Agriculture，39（4）：67-75.]

莫迎，張榮林，范興，薛亞馨，蘇海雁，陸小康，韋鈺. 2019. 植物源食品中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)與分析技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，10（10）：2903-2911. [Mo Y，Zhang R L，F(xiàn)an X，Xue Y X，Su H Y，Liu X K，Wei Y. 2019. Research progress in the detection standards and analytical techniques of plant growth regulators in plant-derived foods[J]. Journal of Food Safety & Quality， 10（10）：2903-2911.]

邱世婷，韓梅，侯雪，郭靈安，雷紹榮，陳巧. 2018. 超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測(cè)蔬菜中23種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，37（6）：660-668. [Qiu S T，Han M，Hou X，Guo L A，Lei S R，Chen Q. 2018. Rapid detection of 23 plant growth regulators in vegetables by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Instrumental Analysis，37（6）：660-668.]

邱暑婷，林學(xué)飛，傅冰夢(mèng)，金鴻銘，許方鑫，吳淑春. 2017. QuEChERS/高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定葡萄中18種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，27（7）：931-936. [Qiu S T，Lin X F， Fu B M，Jin H M，Xu F X，Wu S C. 2017. Simultaneous determination of 18 plant growth regulators in grape by QuEChERS-extraction and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Health Laboratory Technology，27（7）：931-936.]

王運(yùn)儒，鄧有展，陳永森，李乾坤，吳靜娜，楊秀娟，韋璐陽(yáng)，吳鳳，陸仲煙，秦玉燕. 2018. 廣西荔枝農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀及膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，49（9）：1804-1810. [Wang Y R，Deng Y Z，Chen Y S，Li Q K，Wu J N，Yang X J，Wei L Y，Wu F，Lu Z Y，Qin Y Y. 2018. State and dietary intake risk assessment of pesticide residue in litchi in Guangxi[J]. Journal of Southern Agriculture，49（9）：1804-1810.]

夏虹，彭茂民，劉麗. 2018. QuEChERS-超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定柑橘中12種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留[J]. 食品科技，43（10）：340-344. [Xia H，Peng M M，Liu L. 2018. Using QuEChERS method to determine twelve plant growth regulator residues in orange by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Food Science and Technology，43（10）：340-344.]

嚴(yán)煌倩，李勇，翟麗菲，龍玲，程金金，陳小龍，葛靜，楊麗璇，余向陽(yáng). 2018. 氣相色譜—質(zhì)譜法結(jié)合QuEChERS法快速檢測(cè)青椒中15種鄰苯二甲酸酯[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，34（2）：459-465. [Yan H Q，Li Y，Zhai L F，Long L，Cheng J J，Chen X L，Ge J，Yang L X，Yu X Y. 2018. Determination of 15 phthalate acid esters in pepper by gas chromatography-mass spectrometry with QuEChERS method[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，34（2）：459-465.]

張宏軍，張佳，李富根，周普國(guó). 2017. 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑最新登記情況分析[J]. 農(nóng)藥科學(xué)與管理，38（3）：6-14. [Zhang H J，Zhang J，Li F G，Zhou P G. 2017. Analysis on the newly registered plant growth regulators[J]. Pesticide Science and Administration，38（3）：6-14.]

張文華，謝文，侯建波，童赟愷，陸順，汪鵬. 2016. 氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豆芽與番茄中6種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，35（10）：1241-1247. [Zhang W H，Xie W，Hou J B，Tong Y K，Liu S，Wang P. 2016. Determination of 6 plant growth regulators in bean sprout and tomato by gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Instrumental Analysis，35（10）：1241-1247.]

張新中，彭濤，李曉春，張文，苗茜，李晨曦. 2019. 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的殘留與安全性分析[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，10（3）：614-619. [Zhang X Z，Peng T，Li X C，Zhang W，Miao Q，Li C X. 2019. Analysis on the residue and safety of plant growth regulators[J]. Journal of Food Safety & Quality，10（3）：614-619.]

周艷明，付婷，胡睿. 2010. 氣相色譜法測(cè)定蔬菜中三碘苯甲酸殘留量[J]. 食品科學(xué)，31（12）：178-181. [Zhou Y M，F(xiàn)u T，Hu R. 2010. GC determination of 2，3，5-triiodobenzoic acid residue in vegetables[J]. Food Science，31（12）：178-181.]

（責(zé)任編輯 羅 麗）