朱翔 汪宣 王蕾 徐文君 項(xiàng)佳凝 徐瑩 陳麗娜

摘要：建立了一種超高效液相色譜法測(cè)定（UHPLC）包裝紙?jiān)埡桶b紙中2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（MI）、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（CMI）和1，2-苯并異噻啉-3-酮（BIT）含量的快速分析方法。樣品經(jīng)水溶液超聲提取、離心、有機(jī)濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行液相分析，EclipsePlus C18 RRHD色譜柱分離，流動(dòng)相選擇甲酸水-甲醇溶液，采用梯度洗脫方式。此外，還對(duì)提取溶劑、提取時(shí)間、紫外檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了研究。在最優(yōu)檢測(cè)條件下，三種異噻唑啉酮在0.02～5.0 mg L-1范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系（R2均大于0.999），包裝紙?jiān)堉?，低、中、高濃度加?biāo)回收率在80.7～99.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不高于3%，MI、CMI、BIT的檢出限分別為0.0204、0.0310、0.0397 mg kg-1，定量限分別為0.0680、0.103、0.132 mg kg-1。包裝紙中，低、中、高濃度加標(biāo)回收率在80.9～112.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不高于6%，MI、CMI、BIT的檢出限分別為0.0286、0.0189、0.0264 mg kg-1，定量限分別為0.0954、0.0631、0.0880 mg kg-1。該方法已應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，有望為包裝紙的綠色、安全印刷提供保障。

關(guān)鍵詞：異噻唑啉酮；檢測(cè)技術(shù)；超高效液相色譜法；包裝紙；綠色印刷

中圖分類號(hào)：TB484 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1400 （2020） 06-0059-05

A Rapid Determination of Isothiazolinone In Packaging Paper

ZHU Xiang， WANG Xuan， WANG Lei， XU Wen-jun， XIANG Jia-ning， XU Ying， CHEN Li-na（Shanghai Tobacco Packaging And Printing Co.， LTD.， Shanghai 200137， China）

Abstract： A rapid ultra-high performance liquid chromatography （UHPLC） method was developed for the quantitative anaylsis of three isothiazolinone biocides （2-methyl-4-isothiazolin-3-one （MI）， 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one （CMI） and 1，2-benzylisothiazolin-3-one （BIT） in original paper samples and packaging paper. Before UHPLC analysis， the sample was extracted with water， and purified by ultrasonic extraction， centrifugation， and filtration. The sample was separated using a EclipsePlus C18 RRHD column. The mobile phases was formic acid water-methanol under gradient elution. Besides， factors such as extraction solvents， extraction time， and UV detection wavelength were also studied. Under the optimized condition， the method exhibited a linear relationship in the concentration range of 0.02～5.0 mg L-1 （R2>0.999）. In original paper samples， the spike recovery for low， medium and high concentration was in the range of 80.7～99.4% with the relative standard deviations less than 3%. The limits of detection （LOD） were 0.0204、0.0310、0.0397 mg kg-1 and limits of quantification （LOQ） were 0.0680、0.103、0.132 mg kg-1. In packaging samples， the spike recovery was in the range of 80.9～112.4% with the relative standard deviations less than 6%. The limits of detection （LOD） were 0.0286、0.0189、0.0264 mg kg-1 and limits of quantification （LOQ） were 0.0954、0.0631、0.0880 mg kg-1. The method with high accuracy has also been applied to the determination of isothiazolones in real samples. It is a potential technical for green and safe printing of packaging paper.

Keywords： isothiazolones， rapid determination， ultra-high performance liquid chromatography method， packaging paper， green and safe printing

引言

異噻唑啉酮類物質(zhì)由于抗菌能力強(qiáng)、應(yīng)用劑量小、溶解性好、低毒性、低殘留、易降解等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于水處理、鋼鐵冶煉、油田注水、煉油廠、火力發(fā)電廠、大型化肥廠、造紙廠、輕紡、水涂涂料、工業(yè)清洗等領(lǐng)域[1]。其中，制漿造紙工業(yè)中為防止紙張生產(chǎn)過(guò)程中漿料腐敗、變質(zhì)，常使用2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（MIT）、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（CMI）和1，2-苯并異噻唑啉-3-酮（BIT）作為防腐劑。盡管異噻唑啉酮類物質(zhì)毒性較低，但它與皮膚接觸可能引起過(guò)敏或皮炎等反應(yīng)，過(guò)量接觸還可導(dǎo)致皮膚灼傷[2]。國(guó)內(nèi)外對(duì)食品接觸材料、玩具、化妝品等日用品中相關(guān)異噻唑啉酮類殺菌劑的使用均有嚴(yán)格的限制，我國(guó)食品容器和包裝材料標(biāo)準(zhǔn)對(duì)MIT、CMI和BIT的限量要求分別為0.5 mg/kg、不能檢出（N.D.=0.01 mg/kg）和1.2 mg/kg [3]，煙草行業(yè)也將三類有機(jī)殺菌劑列為關(guān)注物質(zhì)，對(duì)其有明確的最大使用量要求。[4]

目前，異噻唑啉酮類殺菌劑的檢測(cè)方法主要包括分光光度法[5]、液相色譜-紫外法（HPLC-UV）[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[7]和氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）[8]。分光光度法中涉及到使用還原劑、顯色劑，步驟較繁瑣、容易引入二次污染；異噻唑啉酮類物質(zhì)極性較大、沸點(diǎn)較高，需衍生化后才能進(jìn)行GC/MS分析，衍生化過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)且需進(jìn)一步凈化，增加了檢驗(yàn)時(shí)間，而且會(huì)導(dǎo)致回收率降低；LC-MS/ MS方法雖然有較好的回收率、較低的檢出限、較高的靈敏度，但是三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀儀器昂貴、參數(shù)設(shè)置較為復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)者的實(shí)驗(yàn)?zāi)芰μ岢龊芨叩囊?，因此檢測(cè)成本較高；同時(shí)，碰撞電壓以及離子源等的優(yōu)化需要較長(zhǎng)的時(shí)間，造成檢測(cè)的時(shí)間偏長(zhǎng)。相比較而言，HPLC-UV方法儀器較為簡(jiǎn)單、操作較為便捷，進(jìn)行簡(jiǎn)單的前處理后即可上樣分析。然而，高效液相色譜法的局限性也很明顯，煙用紙張種類較多，其生產(chǎn)和印刷工藝較復(fù)雜，且異噻唑啉酮類殺菌劑含量較低，它帶來(lái)的問(wèn)題是在檢測(cè)較低濃度樣品時(shí)可能出現(xiàn)假陰性的現(xiàn)象或者受到樣品中其他物質(zhì)的干擾。如何提高檢測(cè)靈敏度是有機(jī)殺菌劑檢測(cè)中的關(guān)鍵所在。超高效液相色譜的出現(xiàn)可以解決目前的問(wèn)題。超高效液相色譜法的原理與高效液相色譜法基本相同，但有更多的優(yōu)點(diǎn)：（1）UHPLC能夠使用更小顆粒的高性能微粒固定相。固定相的顆粒越小、微孔孔徑越大、傳質(zhì)阻力就越小，傳質(zhì)速率就越高，這樣的孔徑更加利于物質(zhì)分離。（2）超高壓輸液泵的使用可以充分發(fā)揮色譜柱的作用，快速分離樣品。（3）UHPLC采用高速采樣、靈敏度更高的檢測(cè)器，提高分析物質(zhì)的能力。（4）UHPLC進(jìn)樣系統(tǒng)使用低擴(kuò)散、低交叉污染自動(dòng)進(jìn)樣器。配備了針內(nèi)進(jìn)樣探頭和壓力輔助進(jìn)樣技術(shù)，使進(jìn)樣更為精確、降低污染的可能性?？傊c傳統(tǒng)的HPLC法相比，UHPLC的分析速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，僅縮短了分析時(shí)間，同時(shí)減少了溶劑用量降低了分析成本。[9]

目前國(guó)內(nèi)雖然有煙用水基膠中異噻唑啉酮類殺菌劑部分研究報(bào)道[10-11]，但卷煙包裝紙中有機(jī)殺菌劑的研究以及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)較少，為此，開發(fā)高靈敏、高效的有機(jī)殺菌劑檢測(cè)技術(shù)具有較為實(shí)際的意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

儀器：Agilent 1290 Infinity II超高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司，配有二極管陣列檢測(cè)器）；電子天平（感量：0.1 mg，瑞士Mettler Toledo公司）；移液器（德國(guó)brand公司）；5804R高速離心機(jī)（德國(guó)eppendorf公司）；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；2700TH超聲波清洗器（上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；cary 100紫外光譜儀（美國(guó)Agilent公司）。

試劑：MI、CMI和BIT（純度≥98%，德國(guó)Dr公司）；色譜純乙腈、甲醇、甲酸、0.22 μm有機(jī)相濾膜、一次性注射器（上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；各種規(guī)格、容量瓶和具塞錐形瓶（德國(guó)witeg公司）：符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

1.2色譜條件

分析柱：EclipsePlus C18 RRHD（50×3.0 mm，1.8μm）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速0.5 mL/min；DAD檢測(cè)波長(zhǎng)：0～2.5 min：275 nm，2.5～7.0 min：318 nm；流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水，B為甲醇；梯度洗脫條件：0～2.5 min，A相為75%，B相為25%；2.5～5.0 min，A相為75%，B相為25%；5.0～7.0 min，A相為75%，B相為25%。由保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取5 mg MI、CMI和BIT于50 mL容量瓶，用水定容配制成濃度為100 mg L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；分別取20、50、100、200、1000、3000、5000 μL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水溶液定容至100 mL容量瓶中，得到0.02、0.05、0.1、0.2、1.0、3.0、5.0 mg L-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4樣品前處理

稱取2.0 g試樣，精確至0.1 mg，置于50 mL具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入20 mL水，蓋緊瓶塞，在超聲儀上以100 W功率超聲30 min，取上層清液過(guò)0.22μm有機(jī)相濾膜，濾液置于進(jìn)樣瓶中待液相色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1色譜條件選擇

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

分別取三種標(biāo)準(zhǔn)溶液與比色皿中，在230～500 nm范圍進(jìn)行紫外光譜掃描，如圖1所示，結(jié)果表明MI、CMI和BIT的最大吸收波長(zhǎng)分別為275 nm、275 nm和318 nm，因此選擇275 nm和318 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)考查了甲酸水溶液-乙腈、甲酸水溶液-甲醇為流動(dòng)相的兩個(gè)體系對(duì)分離分析的影響。甲酸水溶液-乙腈體系雖然分析時(shí)間更短，但考慮實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)基質(zhì)對(duì)測(cè)試會(huì)有一定影響，三個(gè)緊挨著的峰可能會(huì)被基質(zhì)干擾，因此采用甲酸-水溶液進(jìn)行洗脫。

2.1.3流動(dòng)相比例的優(yōu)化

考察了三個(gè)梯度洗脫條件對(duì)色譜峰分離的影響。當(dāng)采取梯度洗脫1條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，三個(gè)色譜峰得到有效分離，并且峰形較尖，然而峰與峰之間時(shí)間間隔較長(zhǎng)，有進(jìn)一步優(yōu)化的空間。因此采用2中條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其保留時(shí)間均縮短，然而第三個(gè)色譜峰的峰形欠佳。針對(duì)第三個(gè)峰的分離采用條件3進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)甲酸水-甲醇的體積比為75：25時(shí)，BIT和MI兩種異噻唑啉酮的分析時(shí)間較短、峰形較好，保留時(shí)間分別為0.64和1.59 min。當(dāng)甲酸水-甲醇的體積比為50：50時(shí)，CMI分分離情況較好，保留時(shí)間為2.59 min?？紤]到實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，基質(zhì)會(huì)引入較多的雜峰，易產(chǎn)生干擾，三種物質(zhì)的保留時(shí)間不宜過(guò)近，才有利于利用外標(biāo)法進(jìn)行分析。因此，最終確定的流動(dòng)相比例為條件3，標(biāo)樣及樣品的色譜圖如圖2所示。

2.2 樣品前處理方法優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道了三種異噻唑啉酮易溶于甲醇、丙酮、乙腈和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，也易溶于水。實(shí)驗(yàn)針對(duì)不同極性的提取劑進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈提取效果差；甲醇對(duì)BIT這種物質(zhì)的回收率較差，僅為50%左右，而水作為提取劑的回收率均在80%以上，因此本研究最終選用了水作提取劑。一方面可以降低使用有機(jī)溶劑，實(shí)驗(yàn)過(guò)程較為綠色環(huán)保；另一方面可以避免甲醇溶劑效應(yīng)的影響，文獻(xiàn)報(bào)道純甲醇提取液直接進(jìn)樣時(shí)，MI有明顯的溶劑效應(yīng)，因此，上機(jī)前采用超純水稀釋來(lái)降低溶劑效應(yīng)，但這會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣、靈敏度降低。[12]

2.2.2 提取時(shí)間的選擇

比較了超聲提取時(shí)間為20，30，40，50 min時(shí)樣品中三種目標(biāo)物的峰面積情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，可見(jiàn)超聲提取時(shí)間對(duì)目標(biāo)物含量測(cè)定的影響不明顯，但考慮到實(shí)際樣品中目標(biāo)物提取的充分性，因此選擇振蕩時(shí)間為30 min。

2.2.3 工作曲線、檢出限和定量限

在最優(yōu)條件下，對(duì)濃度為0.02～5.0 mg L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)物峰強(qiáng)度（Y）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度（X）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，MI、CMI和BIT在0.25～5.0 mg L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)都為R2=0.9999。將最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定6次，所得測(cè)定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍為方法檢出限（LOD），10倍為方法定量限（LOQ），包裝紙?jiān)堉?MI、CMI、BIT的檢出限分別為0.0204、0.0310、0.0397 mg kg-1，定量限分別為0.0680、0.103、0.132 mg kg-1；包裝紙樣品中，MI、CMI、BIT的檢出限分別為0.0286、0.0189、0.0264 mg kg-1，定量限分別為0.0954、0.0631、0.0880 mg kg-1。

2.2.4 精密度和準(zhǔn)確度

精密度是以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。平行試驗(yàn)的精密度可用以驗(yàn)證方法的重復(fù)性。選取三個(gè)加標(biāo)濃度分別進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果見(jiàn)表3、表4，在三個(gè)加標(biāo)水平上，結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，結(jié)果表明方法的精密度良好。

準(zhǔn)確度一般通過(guò)回收率的結(jié)果體現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)測(cè)試了三個(gè)加標(biāo)水平上的6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的加標(biāo)回收率的平均值，所得結(jié)果見(jiàn)表3、表4。包裝紙?jiān)堉?，低、中、高濃度加?biāo)回收率在80.7～99.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不高于3%。包裝紙樣品中，低、中、高濃度加標(biāo)回收率在80.9～112.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不高于6%。結(jié)果表明，該分析方法對(duì)異噻唑啉酮的測(cè)定結(jié)果具有準(zhǔn)確性。

2.2.5 實(shí)際樣品的分析

應(yīng)用所建立的方法測(cè)定包裝紙、包裝紙?jiān)堉挟愢邕蜻臍埩袅?，結(jié)果如表所示，表明包裝紙中異噻唑啉酮的使用量差異顯著，對(duì)其使用量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化管理具有很強(qiáng)實(shí)際意義。

3 結(jié)論

本工作利用超高效液相色譜法建立了一種包裝紙和包裝紙?jiān)堉屑谆愢邕蜻目焖?、高效的檢測(cè)方法。該方法前處理?xiàng)l件綠色環(huán)保，避免使用大量的有機(jī)溶劑；檢測(cè)時(shí)間較短，是一種快速的定性定量方法；線性范圍較寬，不僅滿足低濃度樣品檢測(cè)，也可以可靠測(cè)量高濃度樣品。不足之處在于液相方法靠保留時(shí)間定性，容易受到基質(zhì)干擾，因此，進(jìn)一步工作將聚焦前處理方法的優(yōu)化，以減少基質(zhì)效應(yīng)帶來(lái)的問(wèn)題。

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