黃艷妮，何小華，劉 純，趙 丹，程艷玲

（山東省藥學科學院新藥評價中心，濟南 250101）

0 引言

外科手術(shù)、戰(zhàn)爭和日常生活中因失血過多造成的死亡事件屢見不鮮，快速有效的止血可以減少出血量及患者痛苦，降低死亡率，因此研發(fā)快速止血且可吸收的止血材料是科研工作者努力的方向[1-2]。常用的可吸收止血材料包括纖維蛋白膠、凝血酶抑制劑、聚乙二醇聚合物、殼聚糖和微孔多糖止血微球等，其中微孔多糖止血微球因具有快速的止血效果和良好的生物兼容性，受到越來越多研究者的關(guān)注[3]。國內(nèi)使用的微孔多糖止血微球大多從美國進口，用于創(chuàng)傷止血時可快速形成凝膠混合物，達到即刻止血的效果，但該產(chǎn)品價格昂貴，臨床應(yīng)用受到了一定的限制[4]。目前，國內(nèi)很多科研院所都在研究具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型微孔多糖止血微球[5-6]。本文通過創(chuàng)建新西蘭兔腹壁、小鼠股動脈和股靜脈混合部位及大鼠肝臟部位的活躍出血創(chuàng)面，評價我院研制的新型微孔多糖止血微球?qū)Σ煌瑒?chuàng)面的止血效果，并通過肝臟創(chuàng)面考察微孔多糖止血微球的降解情況，為微孔多糖止血微球的臨床應(yīng)用提供更多試驗動物數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AristaTM止血微球，即市售對照品（美國Medafor-Inc生產(chǎn)，批號：M28851）；微孔多糖止血微球，即供試品（山東省藥學科學院提供，批號：20180726）；戊巴比妥鈉（德國默克公司生產(chǎn)，批號：170108）。

1.2 實驗動物

新西蘭兔18只，體質(zhì)量2.2～2.7 kg，雌雄各半，濟南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）20150001。新西蘭兔飼養(yǎng)于本中心二樓普通級飼養(yǎng)間，室溫：16～26℃，日溫差：≤4℃，相對濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：≥8次/h；晝夜明暗交替時間：12 h/12 h。動物使用許可證號：SCXK（魯）20140008。

健康KM小鼠30只，體質(zhì)量25～29 g，雌雄各半；SD大鼠90只，體質(zhì)量230～300 g，雌雄各半。均由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）20150001。大鼠、小鼠飼養(yǎng)于萬級屏障系統(tǒng)，室溫：20～25℃，日溫差：≤3℃，相對濕度：40%～70%，換氣次數(shù)：10～20 次/h；壓強梯度：20～50 Pa；晝夜明暗交替時間：12 h/12 h。動物使用許可證號：SCXK（魯）20140008。

本試驗經(jīng)過本中心倫理委員會批準。

1.3 主要儀器

ACS-JJ-Tiger型電子計價秤，梅特勒-托利多（常州）測量技術(shù)有限公司生產(chǎn)；Tissue-Tek VIP6全封閉組織脫水機，日本櫻花公司生產(chǎn)；NP-B型生物組織包埋機，湖北諾普醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；RM2235型切片機，德國Leica公司生產(chǎn)；TK-218型攤烤片機，湖北泰維醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；Ni-u熒光顯微鏡，日本Nikon公司生產(chǎn)。

1.4 實驗方法

1.4.1 新西蘭兔腹壁創(chuàng)面止血試驗

將18只健康新西蘭兔按性別、體質(zhì)量隨機分為模型組、供試品組和市售對照品組3組，每組6只。新西蘭兔經(jīng)戊巴比妥鈉（3%，約30 mg/kg）麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺上，常規(guī)脫毛、消毒、開腹，用手術(shù)刀片橫向劃破新西蘭兔腹壁內(nèi)側(cè)造成出血創(chuàng)面，創(chuàng)面大小一致（長5 mm、深3 mm），用無菌紗布擦拭創(chuàng)面后，供試品組和市售對照品組分別將供試品和對照品（約0.3 g）噴灑至創(chuàng)面止血，同時開始計時。模型組擦拭創(chuàng)面后，不做任何處理。每隔30 s用濾紙條輕輕蘸吸創(chuàng)面，直至濾紙條上不再沾有血液為止，記錄所需時間即為有效止血時間。

1.4.2 小鼠股動脈和股靜脈混合創(chuàng)面止血試驗

將30只健康KM小鼠按性別、體質(zhì)量隨機分為模型組、供試品組和市售對照品組3組，每組10只。小鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉（1%，約50 mg/kg）麻醉后，常規(guī)脫毛、消毒，在小鼠右后肢的皮膚暴露股動脈和股靜脈，用滅菌的手術(shù)刀切斷股動脈和股靜脈，用無菌紗布擦拭創(chuàng)面后，供試品組和市售對照品組分別將供試品和對照品（約0.1 g）噴灑至創(chuàng)面止血，并開始計時。模型組擦拭創(chuàng)面后，不做任何處理。每隔30 s用濾紙條輕輕蘸吸創(chuàng)面，直至濾紙條上不再沾有血液為止，記錄所需時間即為有效止血時間。用分析天平精確稱量止血前后濾紙條的質(zhì)量，計算每只小鼠的出血量：出血量（ml）=（止血后濾紙片質(zhì)量-止血前濾紙片質(zhì)量）/血液質(zhì)量濃度（1.050 g/ml）。

1.4.3 大鼠肝臟創(chuàng)面止血試驗及降解情況觀察

將90只健康SD大鼠按性別、體質(zhì)量隨機分為模型組、供試品組和市售對照品組，每組30只。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（1%，約40 mg/kg）麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺上，逐層開腹，游離并暴露肝臟左葉，用組織剪在肝臟左葉中間位置剪下大小一致的一塊肝組織，造成敞開型傷口（4 mm×4 mm），自由出血5 s后，擦去噴出的血液，供試品組和市售對照品組分別將供試品和對照品（約0.1 g）噴灑至創(chuàng)面，模型組的創(chuàng)面擦去血液后，將紗布覆蓋在創(chuàng)面處止血。然后用10 g砝碼壓20 s，取下觀察30 s。如果創(chuàng)面仍在出血再按上述步驟操作，如此循環(huán)直到止血為止。記錄每只大鼠的止血時間。

術(shù)后1、14、28 d分別從上述3組中，隨機取10只大鼠進行解剖，肉眼觀察供試品組和市售對照品組肝臟創(chuàng)面處止血微球的降解情況；取肝臟創(chuàng)面處組織進行組織病理學檢查，在光學顯微鏡下觀察供試品的降解情況，評估止血微球的安全性。止血微球安全性考察依據(jù)GB/T 16886.6—1977《醫(yī)療器械生物學評價 第6部分：植入后局部反應(yīng)試驗》。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)采用±s表示，使用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。止血時間和出血量采用單因素方差比較分析后進行最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）或 Tamhane’s T2 兩兩分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 新西蘭兔腹壁止血試驗

在新西蘭兔腹壁止血試驗中，模型組、供試品組和市售對照組的止血時間分別為（300±28）、（196±54）和（175±46）s。與模型組相比，供試品組和市售對照品組均能明顯縮短腹壁創(chuàng)面的止血時間（P＜0.05），但供試品組與市售對照品組之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），止血效果相當。

2.2 小鼠股動脈和股靜脈止血試驗

小鼠股動脈和股靜脈止血試驗結(jié)果見表1。由表1可以看出，與模型組相比，供試品組和市售對照品組均能夠明顯縮短止血時間、減少出血量（P＜0.05），但供試品組與對照品組之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），止血效果相當。

表1 小鼠股動脈和股靜脈創(chuàng)面止血效果（±s，n=10）

表1 小鼠股動脈和股靜脈創(chuàng)面止血效果（±s，n=10）

注：*表示與模型組比較，P＜0.05

組別 止血時間/s 出血量/ml模型組 180±31 0.61±0.17供試品組 85±27* 0.31±0.15*市售對照品組 84±22* 0.33±0.11*

2.3 大鼠肝臟止血試驗

大鼠肝臟創(chuàng)面止血試驗結(jié)果見表2。由表2可以看出，與模型組相比，供試品組和對照品組均能夠明顯縮短止血時間、減少出血量（P＜0.05），但供試品組與對照品組之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），止血效果相當。

表2 大鼠肝臟創(chuàng)面止血效果（±s，n=30）

表2 大鼠肝臟創(chuàng)面止血效果（±s，n=30）

注：*表示與模型組比較，P＜0.05

組別 止血時間/s 出血量/ml模型組 360±48 1.68±1.04供試品組 220±76* 1.30±0.80*市售對照品組 231±58* 1.29±0.78*

2.4 大鼠肝臟降解試驗

2.4.1 大體觀察

術(shù)后1 d，3組大鼠肝臟左葉創(chuàng)面輪廓清晰，供試品組和市售對照品組大鼠創(chuàng)面處肉眼觀察無止血微球；術(shù)后14 d，3組大鼠肝臟左葉創(chuàng)面基本愈合，供試品組和市售對照品組創(chuàng)面處肉眼觀察無止血微球；術(shù)后28 d，3組大鼠肝臟左葉創(chuàng)面全部愈合，未見異常。不同時間點的大鼠肝臟外觀如圖1所示。

圖1 不同時間點的大鼠肝臟外觀

2.4.2 HE切片觀察

術(shù)后1 d，鏡下觀察供試品組和市售對照品組肝臟局部被膜可見少量、弱嗜酸性、球樣、大小不均的物質(zhì)，周圍可見炎性細胞，可見少量未降解的止血微球；術(shù)后14 d，供試品組和市售對照品組有50%創(chuàng)面局部存在未降解的止血微球；術(shù)后28 d，供試品組和市售對照品組創(chuàng)面均無未降解的止血微球。不同時間點的大鼠肝臟病理切片如圖2所示。

圖2 不同時間點的大鼠肝臟病理切片（HE染色，10×）

3 討論

市面上止血材料種類繁多，按來源分為生物制品類、硅鋁酸鹽類及多聚糖類。大多數(shù)生物制品來源于動物，止血過程需凝血因子或者血小板的參與，止血時間相對較長，且生物制品來源于動物，具有免疫原性和感染的風險。硅鋁酸鹽類是一種特殊結(jié)構(gòu)的礦物質(zhì)，具有排列整齊、大小規(guī)則且與外界相同的通道，可選擇性吸收血液中的水分，使血液中的血小板和凝血因子快速濃縮，多用于戰(zhàn)爭中大面積的創(chuàng)傷止血。多聚糖類包括殼聚糖和微孔多糖止血微球。殼聚糖是一種來源于海洋的高分子化合物，存在一定的致敏性，同時在廣泛止血方面具有一定的局限性。微孔多糖止血微球是一種新型的植物淀粉多糖止血材料，用于滲血創(chuàng)面時，分子內(nèi)部的孔隙發(fā)揮強大的吸水能力，瞬間吸收血液中的水分形成微球凝膠，同時血液中孔徑大物質(zhì)如紅細胞、纖維蛋白、血小板等聚集在微球表面，形成血球凝膠，啟動內(nèi)源性凝血機制。這2種凝膠混合物同時封堵出血點，在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)揮止血作用。該止血劑不含有活性的生物成分，止血迅速、使用方便、毒副作用小，是近年來發(fā)展最快的一種可降解材料[7]。目前，臨床上使用的微孔多糖止血微球多為進口產(chǎn)品，如AristaTM和PerClotTM，這類產(chǎn)品可用于心胸外科、神經(jīng)外科、骨外科、耳鼻喉科等多種外科手術(shù)的止血。此外這類產(chǎn)品還具有防止腸粘連的作用，但因價格昂貴，限制了其臨床應(yīng)用[8-9]。

本文考察了微孔多糖止血微球?qū)π挛魈m兔腹壁創(chuàng)面、小鼠股動脈和股靜脈創(chuàng)面、大鼠肝臟創(chuàng)面的止血效果，并考察了止血微球在大鼠體內(nèi)的降解情況。結(jié)果顯示，微孔多糖止血微球可以顯著減少止血時間和出血量，止血效果與市售對照品相當；在降解試驗中，微孔多糖止血微球在28 d完全降解，肉眼及顯微鏡下觀察均無樣品殘留，安全性較高，與市售對照品相當。綜上，微孔多糖止血微球是一種止血效果好、安全性高的止血材料，值得進一步開發(fā)研究。

但本文僅進行了體表創(chuàng)傷、小血管創(chuàng)傷及肝臟等一般外科手術(shù)創(chuàng)傷的研究，沒有進行胸外、骨外、婦科手術(shù)創(chuàng)傷的研究。此外，在考察產(chǎn)品的安全性方面，沒有觀察供試品對主要臟器（如心、肝、脾、肺等）的影響。今后要根據(jù)實際需要，揚長避短，選擇合適的動物模型，全面評估微孔多糖止血微球的止血效果及安全性。