薛 威， 喜多島敏彥， 高曉冬

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

蛋白質(zhì)天冬酰胺連接的糖基化（N-糖基化）是高等真核生物中重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾途徑。 天冬酰胺連接的糖鏈（N-糖鏈）可以幫助蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正確折疊[1]；在高爾基體中，糖鏈末端的甘露糖會(huì)被水解掉，然后N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I 在糖鏈末端加上一個(gè)N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）[2]，接下來一系列糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)一步修飾糖鏈結(jié)構(gòu)。 各酶的底物特異性和相對(duì)活性的差異導(dǎo)致同一糖蛋白在細(xì)胞內(nèi)也可能攜帶不同的糖鏈結(jié)構(gòu)。 這種糖鏈結(jié)構(gòu)上的異質(zhì)性不僅會(huì)影響蛋白質(zhì)的純化和生產(chǎn)可重復(fù)性，還可能影響藥用蛋白質(zhì)的藥物動(dòng)力學(xué)特性和生物活性[3-4]。 通過基因組編輯改變細(xì)胞N-糖鏈修飾途徑可以優(yōu)化糖鏈結(jié)構(gòu)，然而蛋白質(zhì)的糖鏈依然存在一定異質(zhì)性[5]。

內(nèi)切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶（ENGase）是一類水解N-糖鏈中核心殼二糖之間β-1，4-糖苷鍵的酶類。 它具有兩大家族， 即糖苷水解酶85 家族（GH85）和糖苷水解酶18 家族（GH18）。 GH18，如Endo-H， 具有水解糖苷鍵的功能。 而Endo-M 和Endo-Om 等GH85 除具有水解酶功能外，還可以將整個(gè)寡糖轉(zhuǎn)移到含一個(gè)GlcNAc 的受體上[6-9]。 化學(xué)酶合成法合成均一糖蛋白就是利用該類酶的轉(zhuǎn)糖基功能。 該方法的應(yīng)用潛力受到糖苷酶的底物選擇性及活性的限制，如何開發(fā)出高活性和低底物選擇性的ENGase 仍然是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。

綠色熒光蛋白（GFP）由238 個(gè)氨基酸組成，其11 個(gè)β 折疊和4 個(gè)α 螺旋構(gòu)成圓筒形結(jié)構(gòu)， 通常情況下會(huì)形成二聚體。 將第221 位亮氨酸突變成賴氨酸（L221K）可得到單體綠色熒光蛋白（mGFP）；第65 位絲氨酸突變成蘇氨酸（S65T）后蛋白質(zhì)熒光增強(qiáng)（EGFP）[10]。 自被發(fā)現(xiàn)以來，綠色熒光蛋白及其各種突變體在基因表達(dá)水平研究、 蛋白質(zhì)定位分析、蛋白質(zhì)糖基化研究、膜蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析等方面具有廣泛應(yīng)用[11-15]。研究表明，將GFP 的147 位天冬酰胺突變成蘇氨酸（N147T），使其含有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（N-glycosylatable GFP，Ng-GFP），該突變體熒光強(qiáng)度對(duì)N-糖基化敏感[14]。本研究中作者使用的是熒光增強(qiáng)的單體綠色熒光蛋白（mEGFP） 及其147糖基化突變體Ng-mEGFP。 在與人N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（hGnTI）跨膜區(qū)域（1~99 aa）融合表達(dá)后， 成功將Ng-mEGFP 定位到中國倉鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary cell，CHO K1） 高爾基體中，并篩選出表達(dá)融合蛋白hGnTI- mEGFP （GE）和hGnTI- Ng-mEGFP （GN） 的 單 細(xì) 胞 株K1GE 和K1GN。用衣霉素處理后，K1GN 細(xì)胞熒光強(qiáng)度降低，同時(shí)細(xì)胞糖基化被抑制，二者呈現(xiàn)很好的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株

酵母表達(dá)載體pRS-424-TEF-αfactor-mEGFPHDEL、 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pME18sf-PGKpPuro 和pME-Zeo-hGnTI-EGFP-Flag、 大 腸 桿 菌E. coliDH5α、中國倉鼠卵巢細(xì)胞：均為作者所在實(shí)驗(yàn)室保存； 質(zhì) 粒pRS-424-TEF-αfactor-Ng-mEGFPHDEL：為作者所在實(shí)驗(yàn)室柳藝石構(gòu)建。

1.2 主要試劑

DNA 聚合酶PrimeSTAR、DNA 限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶： 大連TaKaRa 公司； 氨芐青霉素、goat serum 、SanPrep 柱式質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒、SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒、SanPrep 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒： 上海Sangon Biotech；Triton X-100、多聚甲醛：SIGMA；Endo Hf、PNGaseF：NEB；DNA ladder Marker、Mouse Anti-GFP、Goat Anti-Mouse HRP：北京全式金生物；Rabbit Anti-GPP130：BioLegend；BSA、磷酸鹽緩沖液（PBS）、嘌呤霉素、Lipofectamine2000、Alexa Fluor? 488 chicken antimouse IgG （H +L） conjugate、Alexa Fluor ? 555 donkey anti-rabbit IgG （H+L）：Invitrogen。 氯化銨、SDS、NaCl、Tris、HCl：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

封閉緩沖液A：含1% BSA，0.1% NaN3和0.1%Triton X-100 的PBS 溶液。

封閉緩沖液B：含2.5% goat serum，0.05% NaN3和0.1% Triton X-100 的PBS 溶液。

細(xì)胞裂解液：含20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），150 mmol/L NaCl，1% Triton X-100，0.1% SDS 的PBS 溶液。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

以mEGFP 為模板設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物， 在末端加10個(gè)組氨酸作為標(biāo)簽（華大基因合成）：

上游引物 （mEGFP-F）：5’-gcgcACGCGTATGG TGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3’，含MluI 位點(diǎn)；

下游引物（mEGFP-10His-TAA）：5’- aaaaGCG GCCGCTTAGTGGTGGTGGTGATGGTGATGATGATG ATGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAG -3’， 含NotI 位點(diǎn)。

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建

用1.3 中 引 物， 以pRS-424-TEF-αfactormEGFP -HDEL 或 pRS -424 -TEF -αfactor -Ng -mEGFP-HDEL 為模板PCR 擴(kuò)增得到mEGFP 和Ng-mEGFP 的DNA 片段。PCR 條件如下：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性30 s；50 ℃退火30 s；68 ℃延伸80 s，35 個(gè)循環(huán)。 以上PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后雙酶切（MluI 和NotI）； 質(zhì)粒pME-Zeo-hGnTI-EGFP-Flag雙酶切 （XhoI 和MluI） 得到高爾基體定位序列hGnTI； 質(zhì)粒pME18sf-PGKpPuro 雙酶切 （XhoI 和NotI）得到整合質(zhì)?？蛰d體。以上雙酶切（37 ℃、3 h）產(chǎn)物用1 g/dL 瓊脂糖凝膠做膠回收，得到的產(chǎn)物按照2∶2∶1（V∶V∶V）比例加入10 μL 體系連接（16 ℃、3 h）。 取5 μL 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)E. coliDH5α，氨芐青霉素平板篩選陽性克隆子，得到整合質(zhì) 粒 pME18sf -PGKpPuro -hGnTI -mEGFP 和pME18sf-PGKpPuro-hGnTI-Ng-mEGFP。 所有質(zhì)粒均送上海Sangon Biotech 測(cè)序。

1.5 整合質(zhì)粒線性化

按以下操作順序?qū)⒄腺|(zhì)粒pME18sf-PGKpPuro-hGnTI-mEGFP 和pME18sf-PGKpPurohGnTI-Ng-mEGFP 線性化： 取10 μg 質(zhì)粒單酶切（FspI，37 ℃，3 h）； 向酶切體系中加入1/10 體積的醋酸鈉和2.5 倍體積無水乙醇（-20 ℃，20 min）；離心（15 000 r/min、5 min）， 去上清液； 加入500 μL 70% 乙醇，振蕩混勻；離心（15 000 r/min、5 min），去上清液；室溫干燥；將DNA 沉淀溶于20 μL TE 用于線性化轉(zhuǎn)染。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)和線性化轉(zhuǎn)染

CHO K1 細(xì)胞用含10%胎牛血清（BI）的DMEM（Gibco）培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件下于10 cm 培養(yǎng)皿貼壁生長。 轉(zhuǎn)染前，胰酶（Gibco）消化細(xì)胞接種于6 cm 培養(yǎng)皿（接種密度40%）。 培養(yǎng)24 h 后換4 mL 新培養(yǎng)基， 同時(shí)加入線性化質(zhì)粒（Lipofectamine2000 操作手）。培養(yǎng)12 h 后換新培養(yǎng)基。

1.7 單克隆細(xì)胞株篩選和細(xì)胞藥物處理

線性化轉(zhuǎn)染3 d 后，消化細(xì)胞，用含6 μg/mL 嘌呤霉素的DMEM 培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)3 周獲得穩(wěn)定表達(dá)嘌呤霉素抗性基因的混合細(xì)胞株，利用有限稀釋法篩選單細(xì)胞株。

對(duì)于衣霉素（Tunicamycin）處理實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞接種于6 孔板 （接種密度30%）， 用不同濃度衣霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，胰酶消化收集細(xì)胞用于分析。

1.8 流式細(xì)胞儀熒光分析

胰酶消化收集細(xì)胞于1.5 mL 離心管，用500 μL磷 酸 鹽 緩 沖 液 （phosphate buffered saline，PBS，Sangon）洗滌并重懸。 用BD Accuri C6（BD）流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞綠色熒光蛋白質(zhì)信號(hào)。

1.9 激光共聚焦熒光定位分析

細(xì)胞經(jīng)4 ℃PBS 洗兩次后， 用4% 多聚甲醛PBS 溶液孵育20 min 使其固定。 PBS 清洗兩次，然后用50 mmol/L 氯化銨PBS 溶液孵育10 min。 吸去氯化銨溶液， 用封閉緩沖液A 透化細(xì)胞60 min，然后 用 含 一 抗 （Mouse Anti-GFP 或Rabbit Anti-GPP130；1∶400）的封閉緩沖液B 孵育60 min。 用封閉緩沖液A 清洗兩次除去一抗， 然后加入含二抗（Alexa Fluor? 488 chicken anti-mouse IgG （H+L）conjugate 或Alexa Fluor? 555 donkey anti-rabbit IgG（H+L），1∶800）的封閉緩沖液A 孵育60 min。 用Nikon C2si 共聚焦顯微鏡收集細(xì)胞熒光信號(hào)數(shù)據(jù)，NIS-Elements AR analysis4.20.00 處理輸出圖片，Photoshop 調(diào)整圖片對(duì)比度。

1.10 Endo Hf、PNGaseF 處理和蛋白質(zhì)免疫印跡

6 孔板長滿后收集細(xì)胞于1.5 mL 離心管，用500 μL 4 ℃PBS 洗一次，離心除去PBS。 用100 μL細(xì)胞裂解液裂冰上解細(xì)胞30 min，離心（1 500 r/min、10 min）收集上清液蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中加入變性劑，使其終濃度為0.5% SDS 和0.5 mmol/L DTT，然后于95 ℃加熱5 min，使蛋白質(zhì)徹底變性。 每30微升蛋白質(zhì)中加入1 μL Endo Hf 或PNGaseF 于37℃孵育3 h。 用10%聚丙烯酰胺凝膠跑蛋白質(zhì)電泳，用Mouse Anti-GFP （1∶5 000） 和Goat Anti- Mouse HRP（1∶6 000）檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 mEGFP 和Ng-mEGFP 整合質(zhì)粒的構(gòu)建

按照1.4 中的方法， 成功構(gòu)建整合質(zhì)粒pME18sf-PGKpPuro-hGnTI-mEGFP 和pME18sf-PGKpPuro-hGnTI-Ng-mEGFP。 雙酶切經(jīng)1 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在1 066 bp 處為目標(biāo)基因片段hGnTI- mEGFP（圖1 泳道1）和hGnTI- Ng-mEGFP（圖1 泳道2），5 124 bp 處為空載體。

圖1 整合質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證Fig. 1 Confirmation of the plasmids expressing GE and GN

2.2 mEGFP 和Ng-mEGFP 在CHO K1 細(xì) 胞 中的表達(dá)

利用1.6 中的方法將2.1 中質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染CHO K1 細(xì)胞，線性化轉(zhuǎn)染的整合效率較低，作者用嘌呤霉素篩選整合成功的基因。 轉(zhuǎn)染pME18sf-PGKpPuro-hGnTI-mEGFP 后，有39.9%的存活細(xì)胞獲得了GN （圖2 紅色峰圖）； 轉(zhuǎn)染pME18sf-PGKpPuro-hGnTI-Ng-mEGFP 后， 有58.0%存活細(xì)胞獲得了GE（圖2 綠色峰圖）。 結(jié)果顯示，融合了N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的跨膜區(qū)域后，蛋白質(zhì)仍然可以發(fā)出熒光， 且整合了GN 的細(xì)胞熒光明顯弱于GE 的細(xì)胞熒光。 可以用此混合細(xì)胞株篩選出單細(xì)胞株用于進(jìn)一步研究。

2.3 K1GN 和K1GE 單細(xì)胞株的篩選及綠色熒光蛋白質(zhì)定位分析

得到穩(wěn)定表達(dá)GN 和GE 的混合細(xì)胞株后，作者用有限稀釋法篩選出單細(xì)胞株K1GN 和K1GE。單細(xì)胞株K1GN 細(xì)胞熒光強(qiáng)度約為K1GE 細(xì)胞的1/10（圖3（a））。

GPP130 是一個(gè)定位在高爾基體的膜蛋白[16]，被廣泛用于高爾基體定位研究[17]。 作者用GPP130 作為高爾基體定位參照，圖3（b）中間一列紅色熒光定位圖給出了結(jié)合抗GPP130 抗體的二抗發(fā)出的熒光，顯示高爾基體的位置信息。 左側(cè)一列綠色圖給出了結(jié)合抗GFP 抗體的二抗發(fā)出的熒光， 顯示GN在細(xì)胞中的位置。 可以看出GN 與GPP130 定位在相同位置。 結(jié)果表明，作者構(gòu)建的融合蛋白質(zhì)成功定位到了高爾基體。

圖2 線性化轉(zhuǎn)染后混和細(xì)胞株熒光分析Fig. 2 Fluorescence of bulk population after liner transfection

2.4 N-糖鏈對(duì)K1GN 細(xì)胞熒光的影響

衣霉素（Tunicamycin）是一種類核苷酸抗生素，可以抑制阻斷細(xì)胞N-糖鏈合成途徑[18]。使用含有不同質(zhì)量濃度衣霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，2 d后收集細(xì)胞做流式細(xì)胞儀分析。 用DMSO 作為對(duì)照處理細(xì)胞，K1GN 的熒光信號(hào)強(qiáng)度約為1.4×104。 當(dāng)衣霉素質(zhì)量濃度大于0.5 μg/mL 時(shí)， 細(xì)胞熒光信號(hào)開始有明顯降低（圖4（b））。當(dāng)衣霉素質(zhì)量濃度大于1 μg/mL 時(shí)， 細(xì)胞EGFP 熒光信號(hào)峰出現(xiàn)明顯偏移（圖4（a）），此時(shí)細(xì)胞熒光強(qiáng)度約降低30%（圖4（b）（c））。

圖3 單細(xì)胞株熒光分析及GN 定位分析Fig. 3 Fluorescence microscopy of single cell line expressing GN

為確定細(xì)胞熒光強(qiáng)度降低與綠色熒光蛋白的糖基化程度是否有關(guān)系， 作者提取圖4A 中流式細(xì)胞儀分析所剩細(xì)胞的蛋白質(zhì)，做蛋白質(zhì)免疫印跡分析。當(dāng)衣霉素質(zhì)量濃度大于0.5 μg/mL 時(shí)，蛋白質(zhì)糖基化水平明顯降低，且隨著衣霉素質(zhì)量濃度逐漸提高，蛋白質(zhì)糖基化水平會(huì)進(jìn)一步降低，與細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化有很好的相關(guān)性（圖4（b）和圖4（c））。 這一表型在該細(xì)胞株中穩(wěn)定存在。 另外，被糖基化的蛋白質(zhì)條帶1 程彌散狀態(tài)， 用PNGaseF 切除糖鏈后該條帶消失（圖4（c）），表明該蛋白質(zhì)上糖鏈結(jié)構(gòu)不均一，可以通過基因組編輯敲除高爾基體中蛋白質(zhì)N-糖基化途徑中下游特定基因，如St8sia IV、Fut4 等[19-20]，在高爾基體中積累特定糖鏈結(jié)構(gòu)的Ng-mEGFP。

圖4 N-糖基化對(duì)K1GN 細(xì)胞熒光的影響Fig. 4 Effect of N-glycasylation on mEGFP fluorescence

3 結(jié) 語

將N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的跨膜定位區(qū)域與綠色熒光蛋白質(zhì)融合表達(dá)，成功把帶有天冬酰胺連接糖基化位點(diǎn)的單體增強(qiáng)綠色熒光蛋白質(zhì)定位到中國倉鼠卵巢細(xì)胞的高爾基體中，并篩選得到單細(xì)胞株K1GN。流式細(xì)胞儀分析顯示，融合了定位區(qū)域后的綠色熒光蛋白質(zhì)仍可以發(fā)出熒光，在引入糖基化位點(diǎn)后，其熒光強(qiáng)度約降低10 倍。 用含不同質(zhì)量濃度衣霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，蛋白質(zhì)糖基化被抑制，同時(shí)細(xì)胞熒光信號(hào)強(qiáng)度相應(yīng)減弱。 當(dāng)衣霉素質(zhì)量濃度大于1 μg/mL 時(shí)， 細(xì)胞EGFP 熒光信號(hào)峰出現(xiàn)明顯偏移，此時(shí)細(xì)胞熒光強(qiáng)度約降低30%。 本研究證明了該細(xì)胞株熒光強(qiáng)度對(duì)N-糖基化敏感，可以在其高爾基體中表達(dá)ENGase， 檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度及蛋白質(zhì)糖基化水平以判定ENGase 的糖苷水解酶活性。

本研究所用mEGFP 第147 位糖基化突變體，內(nèi)源表達(dá)該突變體的CHO 細(xì)胞在有無糖鏈情況下表現(xiàn)出一定熒光差異。 可以在mEGFP 不同位置引入糖基化位點(diǎn)，以篩選出在有無糖鏈下熒光差異更明顯的突變體。

值得注意的是， 細(xì)胞熒光強(qiáng)度不僅與GN 的糖基化程度有關(guān)，還與該蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表達(dá)量有關(guān)[11]。因此，該細(xì)胞株還可以用于蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)功能基因的高通量篩選研究。