李 祝， 段緒果，2， 宿玲恰，2， 吳 敬*，2

（1． 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江南大學(xué)， 江蘇 無(wú)錫214122； 2． 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 江蘇 無(wú)錫214122）

耐高溫α-淀粉酶由于其優(yōu)良的熱穩(wěn)定性而被廣泛的應(yīng)用于啤酒、酒精、氨基酸及淀粉等工業(yè)領(lǐng)域[1]。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）α-淀粉酶（BLA） 在pH 6~7 之間具有較好的熱穩(wěn)定性， 而當(dāng)pH 在6 以下時(shí)，BLA 的熱穩(wěn)定性將明顯降低，并且催化效率也將受到抑制，不能滿足酸性條件下淀粉原料深加工工藝的要求。 在前期工作中，我們通過(guò)分子改造的手段提高了BLA 在95 ℃、pH 5.5 條件下的熱穩(wěn)定性， 同時(shí)突變體的催化效率也得到提升，該突變體具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[2]。

大腸桿菌由于遺傳背景清晰、 培養(yǎng)成本低廉、能進(jìn)行高密度發(fā)酵等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于重組蛋白質(zhì)的表達(dá)及生產(chǎn)[3]。 相較于胞內(nèi)表達(dá)，胞外表達(dá)重組蛋白質(zhì)具有很多優(yōu)勢(shì)，例如：胞外表達(dá)可以提高重組蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和生物活性，并且胞外表達(dá)更加適合工業(yè)生產(chǎn)[4-5]。 作者所在實(shí)驗(yàn)室的前期工作中發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于嗜熱放線菌（Thermobifida fusca）角質(zhì)酶具有一定的磷脂酶水解活力，可以適量水解大腸桿菌細(xì)胞膜上的磷脂成分，從而增強(qiáng)大腸桿菌細(xì)胞膜透性，進(jìn)而提高重組蛋白質(zhì)的胞外表達(dá)效率[5]。 在前期工作中，重組大腸桿菌表達(dá)BLA 的3 L 罐發(fā)酵研究表明，發(fā)酵上清液中重組BLA 的分泌比例僅為53%，大量的重組蛋白質(zhì)仍然殘留在細(xì)胞內(nèi)。為了實(shí)現(xiàn)BLA 的胞外高效表達(dá)，作者嘗試采用在大腸桿菌中同時(shí)表達(dá)角質(zhì)酶與BLA 的方式來(lái)提高大腸桿菌細(xì)胞膜透性，從而提高BLA 胞外分泌效率。 隨后對(duì)影響大腸桿菌產(chǎn)酶的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化， 以提高BLA 的產(chǎn)量。

pETDuet-1 載體被設(shè)計(jì)用來(lái)在大腸桿菌中同時(shí)表達(dá)兩個(gè)外源基因， 該載體含有兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，并且每個(gè)多克隆位點(diǎn)是通過(guò)T7 啟動(dòng)子、Lac 操縱子和一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)組成。 因此本研究將采用該載體在大腸桿菌中同時(shí)表達(dá)BLA 和角質(zhì)酶基因。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

含有突變后Bacillus licheniformisα-淀粉酶基因的Escherichia coliBL21 （DE3）/pET20b-amy菌株： 由作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏；E. coliJM109、E. coliBL21（DE3）菌株及含有角質(zhì)酶基因的共表達(dá)載體pETDuet-cutinase：均由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

限制性內(nèi)切酶NcoI 和HindIII、 堿性磷酸酶（CIAP）、瓊脂糖和標(biāo)準(zhǔn)核酸相對(duì)分子質(zhì)量：均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒和DNA回收試劑盒：購(gòu)自田根生化科技有限公司；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量和蛋白質(zhì)電泳試劑盒：購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司； 異丙基-β-D-硫代半乳糖 苷 （Isopropyl β -D -1 -Thiogalactopyranoside，IPTG）、 氨芐青霉素 （Ampicillin，Amp）、 卡那霉素（Kanamycin，Kan）： 購(gòu)自上海生物工程股份有限公司；酵母粉和蛋白胨：均購(gòu)自英國(guó)Oxiod 公司；其他試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LB 種子培養(yǎng)基（g/L）： 蛋白胨10， 酵母粉5，NaCl 10；搖瓶TB 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨12，酵母粉24， 甘油5， 磷酸氫二鉀2.34， 磷酸二氫鉀16.43；3 L 罐 發(fā) 酵 培 養(yǎng) 基 （g/L）：（NH4）2HPO44，KH2PO413.5，MgSO4·7H2O 1.38，一水合檸檬酸1.7，蛋白胨1，酵母粉2，甘油8，微量元素液10 mL/L；3 L罐補(bǔ)料培養(yǎng)基（g/L）：甘油600，MgSO4·7H2O 15，蛋白胨2，酵母粉4；3 L 罐誘導(dǎo)培養(yǎng)基（g/L）：乳糖60；微 量 元 素 液 （g/L）：（NH4）6Mo7O240.1，CaCl22.0，MnSO4·4H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 10.0，CuSO4·5H2O 3.0，ZnSO4·7H2O 5.3，Na2B4O7·10H2O 0.2。

1.3 培養(yǎng)條件

1.3.1 搖瓶培養(yǎng)將重組菌接種至含有相應(yīng)抗性的種子培養(yǎng)基中， 在37 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)8 h，以5%的接種體積分?jǐn)?shù)接種至含有相應(yīng)抗性的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 下培養(yǎng)至菌體濃度OD600達(dá)1.0 時(shí)， 加入終濃度為0.02 mmol/L IPTG，隨后將搖瓶至于25 ℃、200 r/min 條件下繼續(xù)培養(yǎng)40 h 至發(fā)酵結(jié)束。

1.3.2 3 L 罐培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基以10%的接種體積分?jǐn)?shù)接種至3 L 發(fā)酵罐中 （Labfors 5，Infors-HT Co.，Ltd）。 在3 L 罐上的發(fā)酵周期可分為3 個(gè)階段。在第一階段中，控制發(fā)酵溫度為37 °C，隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行， 發(fā)酵液中的甘油質(zhì)量濃度和pH 會(huì)逐步降低， 當(dāng)發(fā)酵液中的pH 和溶解氧（DO）突然升高時(shí)，此時(shí)培養(yǎng)基中的甘油耗盡，發(fā)酵進(jìn)入第二階段。 在此階段中，需將補(bǔ)料培養(yǎng)基逐步加入至3 L 罐中，以滿足菌體的生長(zhǎng)需求。 當(dāng)OD600達(dá)到15 時(shí)， 一次性加入終質(zhì)量濃度為10 g/L 的甘氨酸。當(dāng)OD600為50 時(shí)，降低發(fā)酵溫度至32 ℃，同時(shí)加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基以誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)，此時(shí)發(fā)酵進(jìn)入第三階段，即誘導(dǎo)階段。 在此階段中，隨著誘導(dǎo)劑的添加，發(fā)酵液中重組蛋白質(zhì)逐漸積累。 整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中， 通過(guò)轉(zhuǎn)速和通氣量控制發(fā)酵液中的DO 為30%，通過(guò)氨水的添加控制發(fā)酵液中的pH 為7.0。

1.4 方法

1.4.1 共表達(dá)BLA 和角質(zhì)酶載體和菌株的構(gòu)建分別用限制性內(nèi)切酶NcoI 和HindIII 同時(shí)對(duì)質(zhì)粒pET20b-amy 和pETDuet-cutinase 進(jìn)行雙酶切，用DNA 膠回收試劑盒回收相應(yīng)的基因片段，然后將淀粉酶基因amy 和含有角質(zhì)酶基因的共表達(dá)載體pETDuet-cutinase 用T4 連接酶在16 ℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliJM109 并涂布至含有Kan抗性的LB 平板上， 挑取陽(yáng)性克隆至含有Kan 抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，抽提質(zhì)粒，經(jīng)NcoI 和HindIII雙酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒送至測(cè)序公司進(jìn)行基因測(cè)序。 將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E. coliBL21（DE3），構(gòu)建能共表達(dá)BLA 和角質(zhì)酶的重組菌株E. coliBL21（DE3）/ pETDuet-cutinase-amy。

1.4.2 菌體濃度的測(cè)定吸取一定量的發(fā)酵液，將發(fā)酵液用去離子水稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，使得稀釋液在600 nm 下的吸光值在0.2~0.8 之間， 菌體濃度OD600則為吸光值乘以稀釋倍數(shù)。

1.4.3 酶活力的測(cè)定吸取一定量的發(fā)酵液， 在12 000 r/min、4 ℃下離心5 min， 吸取離心后的上清液， 測(cè)量上清液中的重組α-淀粉酶活力即為胞外α-淀粉酶活力。 吸取一定量的發(fā)酵液， 將發(fā)酵液用20 mmol/L、 pH 6.0 的磷酸緩沖液稀釋菌體濃度OD600至5.0， 將稀釋后的發(fā)酵液采用超聲破壁的方法破碎細(xì)胞， 隨后將經(jīng)過(guò)超聲破壁的發(fā)酵液在12 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min，吸取離心后的上清液， 此上清液中所含的α-淀粉酶活力即為總α-淀粉酶活力。

α-淀粉酶酶活力測(cè)定的條件為：底物為1 mL 1%的可溶性淀粉，加入0.9 mL 的磷酸緩沖液（pH 6.0、20 mmol/L） 混勻， 置于70 ℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱3 min，加入100 μL 稀釋好的酶液，在70 ℃下反應(yīng)5 min，之后向反應(yīng)體系中加入3 mL DNS 溶液終止反應(yīng)。將反應(yīng)體系置于100 ℃下處理7 min 后，立刻將反應(yīng)體系放入冰水中降溫。 隨后將體系定容至15 mL，在540 nm 下測(cè)定吸光值，計(jì)算酶活力。 用DNS法[6]制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所用的還原糖為葡萄糖。 在分析條件下，α-淀粉酶每分鐘降解淀粉生成1 μmol的還原糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。 角質(zhì)酶活力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[5]。

1.4.4 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定和SDS-PAGE 分析以牛血清蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用Bradford 方法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度[7]。聚丙烯酰胺凝膠電泳膠的制備采用碧云天蛋白電泳試劑盒進(jìn)行操作，分離膠質(zhì)量濃度12 g/dL，濃縮膠質(zhì)量濃度5 g/dL。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將含有α-淀粉酶基因的重組質(zhì)粒pET20bamy和含有角質(zhì)酶基因的重組質(zhì)粒pETDuetcutinase用NcoI 和HindIII 進(jìn)行雙酶切，膠回收相應(yīng)的目的基因并將其進(jìn)行連接， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliJM109，挑取單克隆提取質(zhì)粒用Nco I 和Hind III 雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖1。 瓊脂糖凝膠電泳顯示約為6 084 bp 和1 443 bp 的兩條片段， 說(shuō)明同時(shí)含有α-淀粉酶基因和角質(zhì)酶基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pETDuet-cutinase-amy。

2.2 共表達(dá)菌株和單表達(dá)菌株的發(fā)酵對(duì)比

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pETDuet-cutinase-amy轉(zhuǎn)化E. coliBL21 （DE3） 構(gòu)建共表達(dá)菌株E. coliBL21（DE3）/pETDuet-cutinase-amy。 首先在搖瓶水平上對(duì)共表達(dá)菌株和單表達(dá)菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶情況進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖2。 從圖2（a）可以看出，在相同的培養(yǎng)條件下，兩種菌株的菌體生長(zhǎng)趨勢(shì)相似。 隨著發(fā)酵的進(jìn)行，兩種菌株的胞外α-淀粉酶活力逐漸升高。當(dāng)發(fā)酵至28 h 時(shí)，共表達(dá)菌株的胞外α-淀粉酶活力達(dá)到最高，為2.21×103U/mL。 而單表達(dá)菌株的胞外α-淀粉酶活力在40 h 達(dá)到最大， 為2.14×103U/mL。盡管兩種菌株所產(chǎn)胞外α-淀粉酶活力相差不大， 但共表達(dá)菌株在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)酶量更大，生產(chǎn)強(qiáng)度更高，具有一定的優(yōu)勢(shì)。

進(jìn)一步在3 L 發(fā)酵罐水平上對(duì)比兩種菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶情況，采用37 ℃生長(zhǎng)、32 ℃誘導(dǎo)，乳糖的誘導(dǎo)強(qiáng)度為0.2 g/（L·h），結(jié)果見(jiàn)圖3。共表達(dá)菌株和單表達(dá)菌株在3 L 罐中的生長(zhǎng)趨勢(shì)相似， 可能由于同時(shí)表達(dá)兩種外源蛋白質(zhì)對(duì)菌體代謝有細(xì)微影響，共表達(dá)菌株的最高菌濃比單表達(dá)菌株的稍低（圖3（a））。 盡管如此，共表達(dá)菌株和單表達(dá)菌株的胞外酶活力有著較大的區(qū)別。 從圖3（b）可以看出，共表達(dá)菌株的胞外α-淀粉酶活力在44 h 達(dá)到最高，為2.87×104U/mL。 而單表達(dá)菌株的最高胞外α-淀粉酶活力為1.69×104U/mL（47 h）。 共表達(dá)菌株胞外最高α-淀粉酶活力為單表達(dá)菌株的1.7 倍。 從發(fā)酵總酶活的數(shù)據(jù)可知，共表達(dá)菌株的總酶活也比單表達(dá)菌株的高（圖3（c））。 因此，共表達(dá)菌株在產(chǎn)酶方面比單表達(dá)菌更加具有工業(yè)應(yīng)用前景。 為了更大限度的提高胞外α-淀粉酶的產(chǎn)量，作者對(duì)影響大腸桿菌產(chǎn)酶的因素進(jìn)行優(yōu)化。

2.3 誘導(dǎo)溫度對(duì)共表達(dá)菌株產(chǎn)酶的影響

誘導(dǎo)溫度對(duì)大腸桿菌表達(dá)外源蛋白質(zhì)有著重要的影響[8-9]。 一般來(lái)說(shuō)，較低的誘導(dǎo)溫度有利于抑制包涵體的生成，從而提高具有生物活性外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量[10]。 為了優(yōu)化誘導(dǎo)溫度，作者在25、32、37℃三種誘導(dǎo)溫度條件下檢測(cè)共表達(dá)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的情況。從圖4 可以看出，誘導(dǎo)溫度為37 ℃時(shí)，菌株的生長(zhǎng)情況最好， 在此條件下菌體濃度OD600最高為116.1。然而，在此條件下的最高胞外α-淀粉酶和總α-淀粉酶活力均為三個(gè)溫度條件下的最低值（1.50×104、2.86×104U/mL）。 當(dāng)誘導(dǎo)溫度為32 ℃時(shí)，此時(shí)的胞外和總α-淀粉酶活力均為最高 （2.87×104、5.47×104U/mL）， 分別為在25 ℃誘導(dǎo)時(shí)的1.43和1.44 倍。在25 ℃條件下誘導(dǎo)時(shí)，較低的誘導(dǎo)溫度可能導(dǎo)致外源蛋白合成速率降低，從而導(dǎo)致重組α-淀粉酶活力減少。 因此，選取32 ℃為共表達(dá)菌株的最適誘導(dǎo)溫度。

圖3 共表達(dá)菌株和單表達(dá)菌株在3 L 罐上的發(fā)酵趨勢(shì)對(duì)比圖Fig. 3 Comparison of time profiles for fermentation in 3 L fermentor between co -expression system and individual expression system

圖4 不同誘導(dǎo)溫度條件下共表達(dá)菌株的發(fā)酵過(guò)程曲線圖Fig. 4 Comparison of time profiles for fermentation of co-expression system under different temperatures

2.4 乳糖誘導(dǎo)強(qiáng)度對(duì)共表達(dá)菌株產(chǎn)酶的影響

充足的誘導(dǎo)強(qiáng)度是大腸桿菌表達(dá)過(guò)量重組的必要條件[10]。然而，誘導(dǎo)劑的添加必須兼顧菌體的生長(zhǎng)和重組蛋白質(zhì)的合成，防止生成大量的包涵體[11]。作者將對(duì)乳糖的誘導(dǎo)強(qiáng)度進(jìn)行優(yōu)化，乳糖添加速率分別在1.0、0.5、0.2 g/（L·h）的條件下檢測(cè)共表達(dá)菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的情況，結(jié)果見(jiàn)圖5。當(dāng)乳糖的誘導(dǎo)強(qiáng)度為1.0 g/（L·h）時(shí)，此時(shí)菌體的最終濃度OD600為94.6，隨著誘導(dǎo)強(qiáng)度的降低，菌體的最終濃度逐漸升高，這可能是由于高誘導(dǎo)強(qiáng)度對(duì)菌體的生長(zhǎng)代謝有壓力，從而抑制了菌體的生長(zhǎng)。 在乳糖誘導(dǎo)強(qiáng)度為1.0 g/（L·h）時(shí)，菌體產(chǎn)酶受到明顯的抑制，α-淀粉酶總酶活及胞外酶活均為最低。 當(dāng)乳糖的誘導(dǎo)強(qiáng)度為0.5 g/（L·h）時(shí)，此時(shí)的α-淀粉酶活力有著明顯的提升，在此條件下，最高α-淀粉酶總活力和胞外α-淀粉酶活力分別達(dá)到9.70×104、5.17×104U/mL，胞外酶活占總酶活的比例為53.3%。 隨著誘導(dǎo)強(qiáng)度的進(jìn)一步降低，共表達(dá)菌株所產(chǎn)α-淀粉酶活力有所下降。 因此，選取乳糖誘導(dǎo)強(qiáng)度為0.5 g/（L·h）。

圖5 不同乳糖誘導(dǎo)強(qiáng)度下共表達(dá)菌株的發(fā)酵過(guò)程曲線圖Fig. 5 Comparison of time profiles for fermentation of co-expression system under different lactose concentrations

2.5 IPTG 和乳糖同時(shí)誘導(dǎo)提高共表達(dá)菌株胞外α-淀粉酶產(chǎn)量

由于穩(wěn)定期的大腸桿菌細(xì)胞膜將變得更加的剛性[12]，并不適合大腸桿菌將重組蛋白質(zhì)分泌至胞外。 因此，在穩(wěn)定期前過(guò)量表達(dá)角質(zhì)酶，盡可能多的水解細(xì)胞膜上的磷脂，從而提高膜透性，可能對(duì)提高胞外α-淀粉酶活力有促進(jìn)作用。 誘導(dǎo)劑IPTG 相對(duì)于乳糖能更快的進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)[13]。因此，作者在誘導(dǎo)前期添加不同濃度的IPTG 來(lái)加強(qiáng)角質(zhì)酶的表達(dá)，同時(shí)持續(xù)添加0.5 g/（L·h）乳糖來(lái)保證誘導(dǎo)強(qiáng)度。

圖6 顯示，在0.1、0.15、0.2 μmol/L IPTG 和0.5 g/（L·h）乳糖誘導(dǎo)時(shí)，共表達(dá)菌株的最高菌濃分別為112.5、107.1、96.4 g/L。在兩種誘導(dǎo)劑共同的作用下，共表達(dá)菌株的胞外α-淀粉酶活力比單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí)有著明顯的增加。 在0.1 μmol/L IPTG 和0.5 g/（L·h）乳糖的誘導(dǎo)條件下，發(fā)酵進(jìn)行31 h 時(shí)，胞外α-淀粉酶活力最高可達(dá)3.97×104U/mL。 當(dāng)IPTG 的濃度增加至0.15 μmol/L 時(shí)，胞外α-淀粉酶活力在發(fā)酵32 h 時(shí)達(dá)到6.05×104U/mL，此時(shí)目的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為8.92 g/L。隨后繼續(xù)提高IPTG 的濃度并不能促進(jìn)胞外α-淀粉酶活力的提升。 蛋白質(zhì)電泳顯示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，胞外BLA 逐漸積累，見(jiàn)圖7。 與總酶活的數(shù)據(jù)對(duì)比可知，IPTG 和乳糖共同誘導(dǎo)時(shí)，胞外α-淀粉酶活力占總酶活的比例有著較大的提升。 在0.1、0.15、0.2 μmol/L IPTG 和0.5 g/（L·h） 乳糖誘導(dǎo)時(shí)的胞外分泌比例分別為88.6%、93.2%和88.4%，見(jiàn)表1。

圖6 不同濃度IPTG 結(jié)合0.5 g/（L·h） 乳糖誘導(dǎo)條件下的共表達(dá)菌株發(fā)酵過(guò)程曲線圖Fig. 6 Comparison of time profiles for fermentation of co -expression system under different IPTG concentrations and 0.5 g/（L·h） lactose

圖7 共表達(dá)菌株3 L 發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程中胞外上清液SDSPAGE 蛋白質(zhì)電泳圖Fig. 7 SDS-PAGE analysis of extracellular α-amylase and cutinase in E. coli C induced with 0.15 μmol/L IPTG and 0.5 g/(L·h) lactose

表1 共表達(dá)菌株在不同發(fā)酵條件下的發(fā)酵數(shù)據(jù)對(duì)比表Table 1 Comparison of parameters for recombinant α-amylase production in E. coli C in fermenter

為了驗(yàn)證IPTG 的添加有助于提高角質(zhì)酶的表達(dá)， 作者在0.5 g/（L·h） 乳糖誘導(dǎo)和0.15 μmol/L IPTG 與0.5 g/（L·h）乳糖共同誘導(dǎo)時(shí)的角質(zhì)酶總酶活進(jìn)行測(cè)定， 結(jié)果見(jiàn)圖8。 從圖8 可以看出， 當(dāng)在0.15 μmol/L IPTG 和0.5 g/（L·h）乳糖共同誘導(dǎo)條件下，角質(zhì)酶的最高酶活力為300 U/mL（34 h）。 而在0.5 g/（L·h）乳糖誘導(dǎo)時(shí)，角質(zhì)酶在相同發(fā)酵時(shí)間下的酶活力為53 U/mL（34 h），僅為IPTG 和乳糖共同誘導(dǎo)時(shí)的17.6%， 并且在此條件下的最高角質(zhì)酶活力為170 U/mL。而角質(zhì)酶酶活的提高可能更多的水解大腸桿菌細(xì)胞膜上磷脂， 從而增加細(xì)胞膜透性，進(jìn)而提高BLA 的分泌效率。

3 討 論

地衣芽孢桿菌來(lái)源的耐高溫α-淀粉酶在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、畢赤酵母等表達(dá)宿主中的重組表達(dá)均有研究，然而國(guó)內(nèi)的大部分研究主要集中在重組蛋白質(zhì)的性質(zhì)研究和重組菌的搖瓶發(fā)酵優(yōu)化[14-16]。本研究將經(jīng)過(guò)分子改造的來(lái)源于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因與嗜熱放線菌角質(zhì)酶基因在E.coliBL21（DE3） 中進(jìn)行共表達(dá)， 構(gòu)建了共表達(dá)菌株E. coliBL21（DE3）/pETDuet-cutinase-amy，并將共表達(dá)菌株與單獨(dú)表達(dá)α-淀粉酶菌株Escherichia coliBL21（DE3）/pET20b-amy進(jìn)行搖瓶和3 L 罐的初步發(fā)酵對(duì)比。 結(jié)果顯示，共表達(dá)菌株在胞外表達(dá)重組α-淀粉酶具有明顯的優(yōu)勢(shì)。 盡管同時(shí)表達(dá)兩種外源蛋白質(zhì)對(duì)大腸桿菌宿主的代謝產(chǎn)生更高的壓力，但是角質(zhì)酶的表達(dá)可以增加大腸桿菌細(xì)胞膜透性，從而使得重組蛋白質(zhì)更加高效的分泌至胞外，減少細(xì)胞內(nèi)重組蛋白質(zhì)的過(guò)量積累。 這種情況下可能進(jìn)而減少包涵體的形成，從而提高具有活性外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量[4]。因此，大腸桿菌內(nèi)BLA 與角質(zhì)酶的共表達(dá)可以提高BLA 的產(chǎn)量。 隨后，作者對(duì)影響大腸桿菌表達(dá)重組蛋白質(zhì)的因素進(jìn)行優(yōu)化。 在優(yōu)化誘導(dǎo)溫度的研究中發(fā)現(xiàn)，37 ℃條件下對(duì)共表達(dá)菌株的生長(zhǎng)有益，然而在此條件下有活性的重組α-淀粉酶卻很少，這可能是由于在較高溫度時(shí)， 重組蛋白質(zhì)快速表達(dá)，大部分重組蛋白質(zhì)來(lái)不及折疊而生成大量的包涵體[17]。 在25 ℃低溫條件下，雖然低溫有利于重組蛋白質(zhì)的折疊，然而低溫不利于重組蛋白質(zhì)的快速表達(dá)[18]。 32 ℃下可以兼顧重組蛋白質(zhì)的合成速率和折疊效率，從而提高有活性重組α-淀粉酶的表達(dá)量。

合適的誘導(dǎo)強(qiáng)度是過(guò)量表達(dá)重組蛋白質(zhì)的必要條件[19]。在乳糖誘導(dǎo)強(qiáng)度的優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，在持續(xù)添加0.5 g/(L·h)乳糖時(shí)，共表達(dá)菌株發(fā)酵產(chǎn)生的總α-淀粉酶活力和胞外α-淀粉酶活力均最高。盡管在此條件下的胞外α-淀粉酶活力比未優(yōu)化前有著較大程度的提高，然而胞外α-淀粉酶活力僅占總活力的53.3%，細(xì)胞內(nèi)仍有大量的重組α-淀粉酶未分泌至胞外。IPTG 和乳糖均可以通過(guò)乳糖啟動(dòng)子誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)[20]。IPTG 可以直接進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，并直接結(jié)合到lac 阻遏蛋白，使得外源蛋白質(zhì)表達(dá)[21]。 而乳糖首先需要在lac 透性酶的幫助下進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，隨后在β-半乳糖苷酶的作用下轉(zhuǎn)變成異乳糖， 進(jìn)而結(jié)合lac 阻遏蛋白以誘導(dǎo)外源蛋白質(zhì)的表達(dá)[12]。 因此，相較于乳糖，IPTG 可以迅速誘導(dǎo)大腸桿菌外源蛋白質(zhì)表達(dá)。 當(dāng)在開(kāi)始誘導(dǎo)階段添加一定濃度的IPTG 并持續(xù)添加乳糖， 共表達(dá)菌株中的重組α-淀粉酶和重組角質(zhì)酶都得到迅速表達(dá)。由于角質(zhì)酶具有一定的磷脂酶活性，角質(zhì)酶的快速表達(dá)可以更好的破壞大腸桿菌細(xì)胞膜，從而增強(qiáng)大腸桿菌細(xì)胞膜透性，提高胞外α-淀粉酶活力。

圖8 在不同誘導(dǎo)條件下角質(zhì)酶總活力的對(duì)比圖Fig. 8 Comparison of the time profiles for total cutinase activity induced with 0.5 g/（L·h） lactose，0.15 μmol/L IPTG and 0.5 g/（L·h） lactose in E. coli C

4 結(jié) 語(yǔ)

構(gòu)建了能同時(shí)表達(dá)α-淀粉酶和角質(zhì)酶的重組菌E. coliBL21（DE3）/pETDuet-cutinase-amy，在與單獨(dú)表達(dá)α-淀粉酶的重組菌E. coliBL21（DE3）/pET20b-amy的搖瓶和3 L 罐的初步發(fā)酵對(duì)比可知，共表達(dá)菌株在胞外表達(dá)重組α-淀粉酶有著明顯的優(yōu)勢(shì)。 對(duì)共表達(dá)菌株的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示， 在誘導(dǎo)溫度為32 ℃， 誘導(dǎo)劑為0.15 μmol/L IPTG 和0.5 g/（L·h）乳糖共同誘導(dǎo)時(shí)，胞外α-淀粉酶活力可達(dá)6.05×104U/mL， 胞外α-淀粉酶蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為8.92 g/L，胞外分泌比例為93.2%，實(shí)現(xiàn)了重組α-淀粉酶的胞外過(guò)量表達(dá)，在工業(yè)生產(chǎn)上具有較好的應(yīng)用前景。