王晨蕾， 劉 松， 堵國成， 陳 堅*

（1. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室， 江蘇 無錫214122；2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 江蘇 無錫214122）

漆酶是含多個銅原子的一種多酚氧化酶，廣泛分布于真菌、高等植物、細菌和昆蟲等生物中[1]。 漆酶可以高效地催化作用于各種酚類及非酚類化合物[2]，伴隨著將氧分子還原為水分子。 漆酶作為化合物合成或結(jié)構(gòu)修飾的催化劑被廣泛應(yīng)用于環(huán)境的生物修復(fù)[3]、生物燃料生產(chǎn)[4]和生物制漿、紡織工業(yè)[5]等。 尤其在造紙工業(yè)中，采用傳統(tǒng)的強酸強堿高溫蒸煮制漿和化學(xué)法漂白，使廢液中含有多種有毒有害的有機化合物[6]。 漆酶作為生物制漿和生物漂白的催化劑在造紙工業(yè)中得到應(yīng)用[7]，與其它木素分解酶相比，漆酶催化效能高、反應(yīng)條件溫和、對反應(yīng)設(shè)備的要求低[8]。 隨著漆酶用途的不斷發(fā)現(xiàn)，對該酶的需求越來越大，因此提高漆酶的產(chǎn)量備受關(guān)注。

漆酶大多來源于絲狀真菌，發(fā)酵周期長、操作復(fù)雜、產(chǎn)生多種漆酶同工酶，阻礙了后續(xù)純化[9]。 異源表達不僅可以克服此障礙，且可采用蛋白質(zhì)工程手段對酶分子改造，既可以提高產(chǎn)量，又能改善酶學(xué)性能[10]，擴大其工業(yè)應(yīng)用。目前漆酶在細菌、植物、酵母中均已實現(xiàn)異源表達。 細菌分泌漆酶能力普遍較低[11-12]，且易形成聚合體難以純化。 Paulo 等[12]在E. coliAH3517 中用5 L 體系發(fā)酵漆酶， 產(chǎn)量最高為5 600 U/L。在轉(zhuǎn)基因植物中，漆酶產(chǎn)量更低，只有50~250 U/L[13-14]。 漆酶在酵母中主要以Pichia pastoris和Saccharomyces cerevisiae為宿主， 已有較多表達成功的例子，然而普遍產(chǎn)量也不高，表達水平不僅與酵母種類有關(guān)，還受漆酶同工酶種類的影響[15]。

巴斯德畢赤酵母（P. pastoris）作為一種相對簡單的真核表達系統(tǒng)，可以對外源重組蛋白質(zhì)進行正確的折疊加工、糖基化修飾等，使用AOX1 強啟動子，以甲醇作為碳源，實現(xiàn)了多種外源產(chǎn)物的高效表達而得到廣泛應(yīng)用[16]。研究報道，不同的蛋白質(zhì)在畢赤酵母中表達時可能有不同的未折疊蛋白質(zhì)響應(yīng)（UPR）效應(yīng)，可以通過改善蛋白折疊加工、運輸、脅迫應(yīng)激等通路來提高UPR 因子效應(yīng)，從而幫助外源蛋白質(zhì)更好地分泌表達[17-19]。 Higashio 等[17]的研究結(jié)果表明， 在S. cerevisiae表達系統(tǒng)中過量表達T. reesei來源UPR 轉(zhuǎn)錄因子HAC1，使α 淀粉酶分泌量提高了2.4 倍。陳鳳祥[18]等在P. pastoris中共表達PDI 使重組菌IFNβ-HAS 表達量提高了90%。

為提高漆酶的表達水平，作者擬通過表達蛋白質(zhì)折疊（BIP、ERO1）、囊泡運輸（SEC53、SEC1）、脅迫應(yīng)激（HAC1、GCN4）等相關(guān)6 種分子伴侶，以期提高Cerrenasp. WR1 漆酶在重組P. pastoris中的表達水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒Cerrenasp. WR1 來源的漆酶（GeneID：899203）：由南京金斯瑞公司按照P. pastoris密 碼 子 偏 好 性 合 成；E. coliJM109、pMD-19T Simple、pGAPZB 和 含 重 組 質(zhì) 粒pPIC9K-laccase 的P. pastoris菌株P(guān)P-L：均為作者所在實驗室保存。

1.1.2 主要試劑限制性內(nèi)切酶PmlI、XhoI 和AvrII：均購自Thermo 公司；膠回收柱回收試劑盒、感受態(tài)制備試劑盒、Primer STAR HS DNA 聚合酶、DNA 連接酶： 均購自大連寶生物TaKaRa 公司；質(zhì)粒提取試劑盒、G418： 購自上海生工生物工程股份有限公司；酵母基因組DNA 抽提試劑盒：購自天根；酵母粉與胰蛋白胨：購自O(shè)xoid 公司；底物ABTS：購自Sigma 公司（美國）；博萊霉素Zeocin（100 mg/mL）：購自Invitrogen 公司；蛋白質(zhì)Maker、考馬斯亮藍染色液： 均購自碧云天生物技術(shù)研究所；NuPAGE?Novex?Bis-Tris 預(yù)制凝膠： 購自Life Technologies 公司；其他常規(guī)試劑及藥品：為國產(chǎn)或進口分裝。

1.1.3 培養(yǎng)基LB 低鹽培養(yǎng)基：0.5 g/dL 酵母提取物，1 g/dL 蛋白胨，0.5 g/dL NaCl，pH 7.0。

YPD 培養(yǎng)基：1 g/dL 酵母提取物，2 g/dL 蛋白胨，2 g/dL D-葡萄糖。

BMGY 培養(yǎng)基：1 g/dL 酵母提取物，2 g/dL 蛋白胨，2 g/dL 甘油，體積分數(shù)10%的100 mmol/L 的PB（pH 6.0）， 體積分數(shù)10%的10×YNB 酵母基礎(chǔ)氮源母液，4×10-5g/dL 生物素。

BMMY 培養(yǎng)基：1 g/dL 酵母提取物，2 g/dL 蛋白胨，2 g/dL 甲醇，體積分數(shù)10%的100 mmol/L 的PB（pH 6.0）， 體積分數(shù)10%的10×YNB 酵母基礎(chǔ)氮源母液，4×10-5g/dL 生物素。

1.2 方法

1.2.1 畢赤酵母分子伴侶共表達質(zhì)粒的構(gòu)建GS115 基因組DNA 依照天根的酵母基因組DNA 提取試劑盒說明書進行。配制0.8 g/dL 的瓊脂糖對抽提的基因組DNA 進行凝膠電泳檢測純度， 使用Nanodrop 檢測其濃度，作為擴增分子伴侶基因的模板。

結(jié)合參考文獻， 作者分別選取蛋白折疊（BIP、ERO1）、 囊泡運輸（SEC53、SEC1）、 脅迫應(yīng)激反應(yīng)（HAC1、GCN4）模塊中的6 個基因，設(shè)計引物擴增P. pastorisGS115 分子伴侶基因，見表1。 取0.5 μL的GS115 基因組DNA 為擴增模板， 分別加入表1中的6 組分子伴侶基因擴增引物，用Primer Star HS高保真酶擴增。 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測確認大小正確后，膠回收，用PmlI 和XhoI 酶切；質(zhì)粒pGAPZB 同樣用PmlI 和XhoI 酶切，柱回收；連接， 構(gòu)建成功6 個分子伴侶的組成型表達質(zhì)粒，并將對分泌表達量有提高的分子伴侶進行組合共表達，構(gòu)建一系列質(zhì)粒及菌株，見表2。

表1 擴增分子伴侶所用引物Table 1 Primers used for amplification of chaperones

表2 本研究使用的菌株和共表達質(zhì)粒Table 2 Strains and plasmids used in this study

1.2.2 畢赤酵母轉(zhuǎn)化與篩選漆酶表達質(zhì)粒：將pPIC9K-Laccase 質(zhì)粒用SalI 單酶切線性化， 柱回收后轉(zhuǎn)化P. pastorisGS115 感受態(tài)，涂布MD 平板，長出單菌落后，用含G418 抗生素的YPD 平板進行拷貝數(shù)篩選。

分子伴侶表達質(zhì)粒：將上述構(gòu)建好的分子伴侶共表達質(zhì)粒，分別進行單酶切（Avr II）線性化，柱回收后轉(zhuǎn)化PP-L 感受態(tài)， 篩選平板選用含博萊霉素Zeocin 的YPD 平板，并進行菌落PCR 驗證，獲得單一目標分子伴侶DNA 條帶的菌株即為陽性轉(zhuǎn)化子；B 類菌株構(gòu)建基于A 類菌株制作的感受態(tài)，同樣電擊轉(zhuǎn)化相應(yīng)線性化質(zhì)粒后， 用含博萊霉素Zeocin 的YPD 平板篩選，菌落PCR 驗證，同時獲得兩條目標分子伴侶DNA 條帶的菌株即為陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 重組菌發(fā)酵種子培養(yǎng)：取重組菌單菌落接種于YPD 培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min 培養(yǎng)14 h 左右活化種子。

生長培養(yǎng)：上述活化的種子液以體積分數(shù)10%轉(zhuǎn)接于BMGY生長培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min 培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將上述培養(yǎng)液以5 000 r/min、4 ℃離心5 min，菌體沉淀用無菌水洗滌1~2 次后，全部轉(zhuǎn)接與BMMY 發(fā)酵培養(yǎng)基中，220 r/min、25 ℃搖瓶培養(yǎng)， 每24 小時補加2%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)， 取樣進行SDS-PAGE 鑒定。

1.2.4 重組菌發(fā)酵生物量的測定菌體從BMGY生長培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到BMMY 發(fā)酵培養(yǎng)基后， 每24 小時取發(fā)酵液，稀釋，測定OD600，計算菌體密度。

1.2.5 漆酶酶活測定漆酶酶活力檢測：取一定的發(fā)酵液，8 000 r/min 離心10 min， 取上清液作為粗酶液。 漆酶反應(yīng)體系為：0.1 mL 酶稀釋液，1 mmol/L的ABTS 0.5 mL，100 mmol/L（pH 3.4）的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液2.4 mL，失活的酶液為空白對照。 漆酶反應(yīng)條件為：30 ℃將ABTS 和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液分別保溫5 min，加入酶液，于420 nm 處測定3 min 內(nèi)吸光值的變化。

1.2.6 SDS-PAGE 凝膠電泳分析樣品與4×Loading buffer 混勻后，72 ℃加熱10 min， 蛋白質(zhì)預(yù)制膠購自Life Technologies 公司，150 V 電泳30 min，具體操作方法參考說明書。

1.2.7 漆酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)測定發(fā)酵液8 000 r/min，4 ℃低溫離心10 min，得含漆酶的上清液。 將上清液放在冰中保持低溫，在磁力攪拌器上邊攪拌邊加入硫酸銨粉末使其終質(zhì)量濃度為75 g/dL，離心后將沉淀用A 液（10 mmol/L 的PB，pH 6.0）復(fù)溶后放入透析袋中，磁力攪拌器攪拌24 h，用0.25 μmol/L的微孔濾膜過濾， 所得樣品用5 mL 陰離子柱Q 柱進行純化。 柱純化條件如下：用5~10 倍柱體積的A液對Q 柱進行平衡， 待電導(dǎo)穩(wěn)定后， 流速設(shè)置為1 mL/min 從進樣管道進樣； 流速設(shè)置為3 mL/min，用5 倍柱體積的A 液淋洗柱子；以0、20%、40%、60%、80%、100%的B 液（10 mmol/L 的PB，pH 6.0，1 mol/L NaCl）進行梯度洗脫；取測到漆酶酶活的洗脫液在A液中過夜透析，4 ℃保存。

漆酶蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定按照Bradford 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定試劑盒操作說明書進行；適當(dāng)稀釋純化后的漆酶測定酶活力及蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度后，計算比酶活；

按照1.2.5 方法在不同溫度下（20~70 ℃，以5 ℃為間隔）測定酶活力，得到最適溫度；在最適條件下，分別以不同濃度ABTS（檸檬酸-檸檬酸鈉溶液）為底物， 測定不同ABTS 濃度下漆酶的酶活力，Km和Vmax用GraphPad Prism5 擬合得到； 分別測定酶液在50、60、70 ℃保溫0~220 min 殘留酶活，計算t1/2。

2 結(jié)果與討論

2.1 共表達質(zhì)粒的構(gòu)建

按照圖1 構(gòu)建各共表達質(zhì)粒， 以1.2.1 所述方法PCR 擴增這6 種分子伴侶基因片段，得到與理論值大小一致的條帶， 見圖2 （a）。 將各擴增基因的PCR 產(chǎn)物回收后，以表1 所列的相應(yīng)酶切位點雙酶切，pGAPZB 用相同酶切位點雙酶切后連接、 轉(zhuǎn)化，提取重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，見圖2（b）。 各重組表達質(zhì)粒的命名見表2。 用于轉(zhuǎn)化的各表達質(zhì)粒均測序驗證，測序結(jié)果與理論值一致。

2.2 共表達菌株產(chǎn)漆酶驗證

將測序驗證正確的各個共表達質(zhì)粒分別用Avr II 單酶切線性化后，電擊轉(zhuǎn)化PP-L 菌株，使用含博萊霉素Zeocin 的YPD 平板篩選后， 挑取A 類菌株使用pGAPZB 通用引物進行菌落PCR 驗證。 將A類菌株的陽性轉(zhuǎn)化子進行發(fā)酵，測定漆酶產(chǎn)量。

為了考察組成型共表達各分子伴侶是否對親本菌株生長產(chǎn)生不利影響，將構(gòu)建的各共表達菌株在BMMY 培養(yǎng)基上的生長曲線進行測定，結(jié)果見圖3。 各共表達菌株的生長與對照菌株（PP-L）沒有顯著差異，說明共表達質(zhì)粒的整合沒有影響菌株生長。

圖1 共表達質(zhì)粒構(gòu)建流程圖Fig.1 Construction of co-expression plasmid of chaperones

圖2 GS115 來源的分子伴侶編碼基因的克隆和重組共表達質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig. 2 Cloning of chaperones coding genes from GS115 and identification of recombinant plasmids for chaperones

圖3 含分子伴侶菌株的生長曲線Fig. 3 Growth curves of strains with additional cassette of chaperones

篩選表達量提高最明顯的各共表達菌株轉(zhuǎn)化子作進一步的表達分析。 以表達菌株P(guān)P-L 作為對照，在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)各共表達菌株，發(fā)酵7 d 后離心取上清液，進行SDS-PAGE 分析，見圖4。結(jié)果表明，各共表達菌株均成功表達漆酶，與對照菌株相比，表達量有不同程度的提高。取發(fā)酵7 d 的發(fā)酵液離心取上清液作為粗酶液，測定各菌株的漆酶酶活力，見圖5。各共表達菌株的酶活力有不同程度的提高，PP-L-ERO1 除外。 尤其是PP-L-BIP 的酶活力為對照菌株的4.59 倍。

圖4 各共表達菌株發(fā)酵上清液SDS-PAGE 電泳分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of additional overexperssion cassette of chaperones

為了考察不同模塊的分子伴侶對外源蛋白質(zhì)表達的影響，選取上述各模塊中效果好的A 類菌株進行不同模塊間的組合共表達，即對表2 中的6 種B 類菌株進行發(fā)酵。

圖5 搖瓶發(fā)酵各共表達菌株的相對酶活Fig. 5 Effects of co-expression of chaperones on the laccase in shake flasks

如圖6 所示，組合共表達菌株的產(chǎn)量基本都有不同程度的提高（6%~53%），部分組合共表達菌株較單個共表達菌株胞外酶活下降， 如P4、P2 下降26%。

圖6 不同共表達基因組合優(yōu)化對異源表達漆酶的影響Fig. 6 Optimization of different co-expression chaperones on heterologous protein production of laccase in P.pastoris

2.3 漆酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)測定

按照1.2.7 所述方法對漆酶進行純化， 在20%梯度洗脫時漆酶被洗脫出來。 SDS-PAGE 純化條帶單一，見圖7。 用Bradford 測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，然后計算比酶活并測定最適溫度、Km、kcat、溫度穩(wěn)定性（50、60、70 ℃），見表3。

圖7 純化的漆酶的SDS-PAGE 蛋白質(zhì)電泳分析Fig. 7 SDS-PAGE of purified laccase

2.4 共表達分子伴侶影響漆酶蛋白活力機制解析

外源蛋白質(zhì)的分泌表達需要多個環(huán)節(jié)調(diào)控，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中蛋白質(zhì)折疊成天然構(gòu)象后被初步修飾， 轉(zhuǎn)運到高爾基體中作進一步糖基化等修飾，經(jīng)囊泡運輸?shù)拳h(huán)節(jié)最終分泌到胞外，錯誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)則被降解。 傳統(tǒng)提高酶活的方法大都集中在發(fā)酵條件的優(yōu)化、啟動子、信號肽、密碼子優(yōu)化等方法上。 作者首次通過過表達不同功能模塊的分子伴侶來提高漆酶的產(chǎn)量，最終得到一株較出發(fā)菌株漆酶酶活力提高602%的菌株。 這是因為初生肽鏈結(jié)合在ER 中的BIP 分子伴侶后穩(wěn)定性增強，折疊效率提高[20]；大量未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)會使細胞產(chǎn)生未折疊蛋白質(zhì)響應(yīng) （UPR），HAC1 通過過表達其控制的ERO1、SEC1 等分子伴侶以緩解代謝壓力，調(diào)控UPR 信號[21]，促進蛋白質(zhì)折疊效率。 上述結(jié)果說明漆酶在P. pastoris中的折疊能力和未折疊蛋白質(zhì)引起的脅迫壓力是限制漆酶高效表達的關(guān)鍵因素。

表3 漆酶的動力學(xué)特征Table 3 Kinetic proerties of laccase

3 結(jié) 語

關(guān)于漆酶的異源表達已有大量研究報道，然而從細胞層面對菌株改造鮮有報道。 本研究第一次通過共表達分子伴侶提高漆酶在P. pastoris中的分泌表達。 結(jié)果顯示， 過表達酵母中蛋白質(zhì)折疊（BIP、ERO1）、 運輸 （SEC53、SEC1）、 脅迫應(yīng)激（HAC1、GCN4）通路中的相關(guān)分子伴侶，與PP-L（胞外活力為555 U/L） 相比， 胞外漆酶活力提高18%-359%（ERO1 除外），其中共表達BIP 酶活力提高了359%，250 mL 搖瓶發(fā)酵使得胞外酶活達2 547 U/L； 接著組合共表達不同模塊中效果較好的共表達元件，漆酶產(chǎn)量進一步提高6%-53%，重組菌P1（同時共表達BIP 與HAC1） 較PP-L 胞外漆酶酶活力提高602%，250 mL 搖瓶發(fā)酵胞外酶活力最高達3 896 U/L。本研究首次通過過表達不同功能模塊的分子伴侶來提高漆酶的產(chǎn)量，研究結(jié)果表明，這一措施有顯著效果，這一舉措對促進漆酶的產(chǎn)業(yè)化進程提供了新的思路。