蘇琳琳 周歡娣 薛曉英

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

手術(shù)、放療、化療是癌癥的三大主要治療手段。世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，三者對癌癥治療的貢獻率分別為27%、22%、和6%，其中放療的作用與手術(shù)相當。另據(jù)WHO統(tǒng)計，腫瘤患者中近70%患者需要放射治療。放療會影響腫瘤發(fā)生特異性免疫，包括顯著增加 CD8+T細胞啟動〔1〕、增強腫瘤特異性抗原釋放〔2〕、誘導免疫原性細胞死亡(ICD)〔3〕、促使主要組織相容性復合體(MHC)Ⅰ和新抗原表達〔4〕、促進Ⅰ型干擾素(IFN)〔5〕和補體生成〔6〕、提高活化性受體凝集素樣同型二聚體(NK2GD)配體表達〔7〕。放療誘導的ICD會導致胞外鈣網(wǎng)蛋白過表達，并釋放損害相關(guān)性分子模型(DAMPs)高機動性組盒(HMGB)1和三磷酸腺苷(ATP)。這些分子可募集并激活抗原提呈細胞，進而啟動與腫瘤特異性抗原相關(guān)的T細胞反應(yīng)〔8，9〕。由此可見，放療與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系十分密切。其中，放療過程中出現(xiàn)的遠隔效應(yīng)就是這一復雜關(guān)系的產(chǎn)物之一。而外泌體作為腫瘤免疫微環(huán)境成員之一，對腫瘤的生物學行為及輻射誘導的旁效應(yīng)影響重大。本文對放療與腫瘤微環(huán)境的相關(guān)進展進行綜述。

1 放療與外泌體

1.1外泌體概況 細胞可分泌各種酶類、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、局部介質(zhì)、血清蛋白、抗體、細胞外基質(zhì)等成分。此外，還可釋放一些囊泡類物質(zhì)，細胞釋放到胞外微環(huán)境的囊泡主要有三種類型：外泌體、細胞微泡和凋亡小體〔10〕。外泌體是一種膜性結(jié)構(gòu)的囊泡，直徑最小為50～150 nm，來自胞內(nèi)早期形成的多囊體，可由正常細胞和腫瘤細胞釋放，內(nèi)含微小RNA、信使RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等成分〔11〕。外泌體的生物進程包含四個主要步驟：起始膜形成、胞吞、多囊體形成、分泌至胞外或被溶酶體溶解。因其參與細胞之間的通信交流〔12〕、免疫反應(yīng)〔13〕和凋亡逃逸〔14〕，近些年最受關(guān)注。

1.2放療對外泌體形成分泌及構(gòu)成的影響 外泌體的前體是細胞膜形成的早期多囊體，釋放到細胞外通過吞噬或膜融合的方式由受體細胞攝取，進而激活細胞內(nèi)某一特殊過程。電離輻射對外泌體釋放最顯著的兩個影響因素為：輻射誘導的DNA損傷及p53相關(guān)通路的激活。放療不僅會直接導致DNA的損傷，還可激活許多相關(guān)通路，p53就是其中之一。受環(huán)境應(yīng)力影響的p53蛋白可調(diào)節(jié)許多基因的轉(zhuǎn)錄，一些受此蛋白調(diào)節(jié)的分泌蛋白會參與相鄰細胞的信息交流。Yu等〔15〕應(yīng)用蛋白質(zhì)組學的方法探測受照射的細胞培養(yǎng)基中依賴p53通路分泌的蛋白含量，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中除了已知的p53基因轉(zhuǎn)錄的蛋白，許多非p53基因轉(zhuǎn)錄的基因編碼蛋白在激活p53后也有所增加，這些蛋白由外泌體攜帶至胞外。并發(fā)現(xiàn)一種由p53調(diào)節(jié)的基因產(chǎn)物——血清總酸性磷酸酶可提高微環(huán)境中外泌體的形成分泌，進而與臨近細胞甚至免疫系統(tǒng)細胞進行信息交流。

外泌體不僅是內(nèi)含細胞殘骸的質(zhì)膜性胞外囊泡，還包含某些特殊的分子。ExoCarta 2012數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)總結(jié)了不同來源外泌體的分子構(gòu)成情況，包括外泌體的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA〔16〕。外泌體的構(gòu)成主要取決于分泌細胞的類型，也受分泌細胞暴露條件的影響，其中最主要的暴露因素是電離輻射。有研究認為電離輻射對外泌體構(gòu)成的影響取決于細胞模型和電離輻射模式的不同：Arscott等〔17〕用4 Gy的電離輻射(IR)照射24～48 h多形性成膠質(zhì)細胞瘤細胞U87MG，結(jié)締組織生長因子mRNA及 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2抗體蛋白表達水平顯著提高；Lehmann等〔18〕用4 Gy的IR照射前列腺癌細胞(22Rv1)96 h，檢測到B7-H3蛋白含量顯著增多；Hurwitz等〔19〕證明經(jīng)放療的病人血清中熱休克蛋白72含量增多；Jelonek等〔20〕則用以2 Gy的劑量照射人頭頸部鱗癌細胞(FaDu)18 h后，參與翻譯轉(zhuǎn)錄的蛋白真核起始因子(EIFs)，葉酸水解酶(PSMs)，核糖體蛋白(RPLs)和核蛋白體蛋白(RPSs)、與細胞周期或細胞分裂有關(guān)的蛋白(分子伴侶、泛素化相關(guān)蛋白和蛋白酶)及細胞信號蛋白核糖基化作用因子(ARFs)，Rab蛋白(RABs)及Ras蛋白(RASs)含量增多，而載脂蛋白類和免疫球蛋白類表達水平則降低。盡管上述研究的對象和結(jié)果不同，但一致認為外泌體運載的物質(zhì)確實反映了電離輻射導致的細胞特定變化。

1.3外泌體的功能及對放療的影響 正常細胞的外泌體參與啟動免疫調(diào)節(jié)活動。外泌體攜帶的MHC-肽復合物與同源T細胞受體結(jié)合激活致敏性CD4+/CD8+T淋巴細胞〔21，22〕，進而協(xié)助啟動機體的免疫反應(yīng)，保護機體免受腫瘤等異物傷害。外泌體激活免疫反應(yīng)的能力與其攜帶的膜抗原有關(guān)〔23〕，免疫效應(yīng)則取決于細胞的生理狀態(tài)〔24〕。

腫瘤細胞分泌的外泌體也可能攜帶免疫抑制肽復合體，通過某些機制抑制機體免疫反應(yīng)。有研究證明外泌體能夠減慢自然殺傷細胞〔25〕或CD4+/CD8+T細胞〔26〕的增殖、促進骨髓細胞〔27〕和調(diào)節(jié)T細胞〔28〕的變異，從而抑制或干擾機體的免疫反應(yīng)，幫助腫瘤逃脫免疫監(jiān)視，促進腫瘤生長。來自腫瘤細胞的外泌體還與腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究表明〔17〕，照射引起的外泌體特定變化在一定程度上通過加強神經(jīng)生長因子(NGF)-酪氨酸蛋白激酶(Trk)A及黏著斑激酶(FAK)信號通路的激活促進腦膠質(zhì)瘤細胞的遷徙和轉(zhuǎn)移。

近來有研究強調(diào)環(huán)境應(yīng)力對外泌體調(diào)節(jié)細胞間信息交流影響重大，并證明電離輻射可通過不同的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)顯著影響細胞之間的信息交流。外泌體通過向周圍或遠處靶細胞傳遞與細胞凋亡、生存、分裂、生長、變異有關(guān)的或多重或獨特的信號調(diào)節(jié)細胞之間的信息交流〔29〕，進而影響腫瘤生物學行為及治療效果。與輻射相關(guān)的細胞間信息交流對放療影響最明顯的是輻射誘導的旁效應(yīng)，是指通過細胞接觸或細胞間通訊將直接受照射細胞的應(yīng)答傳遞給周圍未受輻射的細胞，后者也表現(xiàn)出與受照射細胞類似的生物學效應(yīng)〔30～35〕。外泌體在RIBE中發(fā)揮著關(guān)鍵作用：Al-Mayah等〔36，37〕先后證明受照MCF7 細胞的旁效應(yīng)，與輻射引起的基因不穩(wěn)定性和外泌體的含量及其攜帶的RNA、蛋白質(zhì)息息相關(guān)。

此外，受照細胞對外泌體的攝取也受影響。有研究〔38〕表明，暴露于電離輻射的人骨髓源性細胞會通過CD29/CD81絡(luò)合物的生成和依賴p38絲裂原活化蛋白激酶的胞吞和胞飲增加對外泌體的攝取。

2 遠隔效應(yīng)

Mole〔39〕最初描述道，放療的遠隔效應(yīng)是指照射原發(fā)腫瘤，照射路徑外的遠處轉(zhuǎn)移瘤體也有反應(yīng)的現(xiàn)象。腫瘤免疫反應(yīng)的抑制支持了免疫系統(tǒng)對遠隔效應(yīng)有影響的假設(shè)。我們認為遠隔效應(yīng)是由系統(tǒng)抗腫瘤免疫反應(yīng)引起的，但這種現(xiàn)象在臨床實踐中很罕見〔40〕。系統(tǒng)免疫反應(yīng)的缺失是由腫瘤微環(huán)境中局部免疫抑制造成的。免疫效應(yīng)細胞包括骨髓衍生抑制細胞(MDSC)、FoxP3+T調(diào)節(jié)細胞(Tregs)、抑制性細胞因子(如：轉(zhuǎn)化生長因子-β、白細胞介素-10)和一些“免疫檢查點”分子，這些會引起局部T細胞抑制〔41〕及樹突細胞的亞最佳啟動。

2.1遠隔效應(yīng)的臨床證據(jù) 放療本身的遠隔效應(yīng)臨床罕見且目前只有案例報告。繼1953年Mole之后，Ehlers、Rees、Ohba、Wers?ll、Postow、Golden等又先后在乳頭狀腺癌〔42，43〕、肝細胞癌骨轉(zhuǎn)移〔44〕、腎細胞癌腦轉(zhuǎn)移〔45〕、黑色素瘤〔46〕、轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌〔47〕的放療過程觀察并報道了這種效應(yīng)。最近，Reynders等〔40〕總結(jié)了1973～2013年間23例在單獨放療中出現(xiàn)遠隔效應(yīng)的案例，中位年齡為64.5(28～83)歲，腎細胞癌是最常見的組織類型，原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤分別占35%、65%，中位劑量為32(12.00～60.75)Gy，1.2～26.0 Gy/f。出現(xiàn)遠隔效應(yīng)的平均時間是開始放療后5個月(1～24個月)，隨訪結(jié)束或疾病進展前13個月。

2.2遠隔效應(yīng)的基礎(chǔ)研究 遠隔效應(yīng)確實是由免疫系統(tǒng)介導的。Demaria等〔48〕應(yīng)用小鼠乳腺癌67NR模型證實了這個觀點，并證明這種效應(yīng)具有癌種特異性。其在試驗中觀察到放療聯(lián)合生長因子Flt3配體(Flt3-L可增加樹突細胞的數(shù)量)可在同一小鼠另一相同癌種的瘤體中觀察到遠隔效應(yīng)，而同一小鼠不同癌種的瘤體、單獨應(yīng)用Flt3-L或在T細胞缺陷模型中均無此現(xiàn)象；而后又利用小鼠免疫缺陷型轉(zhuǎn)移性乳腺癌4T1模型〔49〕證實局部放療原位乳腺癌和抑制細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原(CTLA)-4聯(lián)合應(yīng)用可提高對肺轉(zhuǎn)移癌的控制。Dewan等〔50〕在TSA小鼠乳腺癌模型和MCA38小鼠結(jié)腸癌模型中同樣證實分割放療聯(lián)合應(yīng)用CTLA-4抗體才可誘發(fā)遠隔效應(yīng)。

長期以來，我們一直認為局部放療的作用機制為射線對腫瘤細胞的直接殺傷作用，即導致腫瘤細胞DNA損傷。近來有學者證明，放療的“場域”效應(yīng)也依賴于免疫系統(tǒng)。包括促進腫瘤抗原擴增、改變和表達，激活免疫應(yīng)答，誘導T細胞應(yīng)答，調(diào)節(jié)腫瘤間質(zhì)細胞等。 Lee等〔1〕應(yīng)用小鼠模型研究證明放療會顯著增強淋巴組織中T細胞啟動導致原位腫瘤和遠處轉(zhuǎn)移瘤體通過依賴CD8+T細胞的形式縮小甚至消失，并進一步證明這種由放療啟動的免疫反應(yīng)和瘤體縮小效果會隨著長期傳統(tǒng)分割放療或輔助化療減弱，卻會因局部免疫治療增強。有研究還證明局部高劑量放療可引發(fā)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生，進而啟動先天性和獲得性免疫反應(yīng)攻擊腫瘤〔51〕，但若樹突細胞中缺乏IFN-α/β 受體1則不能將免疫原性的腫瘤細胞抗原呈現(xiàn)給CD8+T細胞〔52〕。

2.3如何增強放療的遠隔效應(yīng) 免疫治療正在開辟新前景以增強遠隔效應(yīng)。上文已敘述放療與CTLA-4抗體、放療與Flt3-L聯(lián)合應(yīng)用在小鼠模型中均可促進遠隔效應(yīng)的出現(xiàn)。研究表明：當前大部分免疫治療通過抑制CTLA-4、程序性死亡受體(PD)-1、TIM3等免疫抑制因子及抑制間質(zhì)細胞(如 MDSC)來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進 T細胞活化和應(yīng)答〔53〕。因此，PD-1、TIM3、MDSC有可能成為新的免疫位點與放療聯(lián)合應(yīng)用。

在臨床工作中，Postow等〔46〕首次報告了1例黑色素瘤轉(zhuǎn)移患者放療期間出現(xiàn)的遠隔效應(yīng)，但在伊匹單抗(一種可以抑制T細胞免疫檢查點的單克隆抗體，CTLA-4) 維持治療期間疾病發(fā)生進展。此外，Postow等〔46〕還證明腫瘤縮小和免疫抗體反應(yīng)具有時間相關(guān)性，并發(fā)現(xiàn)外周血免疫細胞(骨髓生成抑制細胞和激活的CD8+CD4+T細胞)也有變化〔46〕。此后，又有研究先后〔46，54～57〕報告了黑色素瘤患者在伊匹單抗治療時存在遠隔效應(yīng)?？偨Y(jié)得知，首次注射伊匹單抗和開始放療的時間間隔為1.5～18個月，出現(xiàn)遠隔效應(yīng)的時間是放療開始后1～6個月。Stamell等〔55〕還觀察到在遠隔效應(yīng)出現(xiàn)期間抗黑色素瘤抗體增加，MAGEA3也伴隨增多，并出現(xiàn)針對癌癥抗原PASD1的新反應(yīng)。

3 放療如何發(fā)展以提高治療效果

電離輻射不但能夠誘發(fā)免疫原性癌癥細胞死亡，還作為一種危險因子發(fā)放免疫信號排斥腫瘤〔58〕。電離輻射可觸發(fā)腫瘤免疫排斥機制，首先將腫瘤轉(zhuǎn)化為獨特的原位疫苗并激發(fā)獲得性免疫反應(yīng)，通過外泌體及其介導的旁效應(yīng)和遠隔效應(yīng)影響原位腫瘤及遠處轉(zhuǎn)移瘤體。但在許多情況下，僅靠電離輻射不能抵制腫瘤特異性免疫抑制。盡管已觀察到輻射會誘發(fā)遠隔效應(yīng)并調(diào)節(jié)機體對腫瘤的免疫反應(yīng)，但這種反應(yīng)在臨床實踐中很少見。雖然放療本身足以提供細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)對腫瘤抗原交叉啟動的必要信號，但這種輔助作用似乎相對較弱。放療會激活新的抗腫瘤CTLs，但對尚未治療的遠處轉(zhuǎn)移腫瘤，CTLs通常無法克服腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用。

但以上一系列研究已證實無論是放療使瘤體縮小的直接作用機制，還是由外泌體介導的旁效應(yīng)，亦或遠隔效應(yīng)均與腫瘤免疫微環(huán)境密切相關(guān)甚至可通過聯(lián)合免疫治療強化放療療效。這給我們一個重大啟示：將系統(tǒng)免疫療法與放療相結(jié)合來提高腫瘤的治療效果。而免疫位點、放療模式與兩者結(jié)合的時機目前尚無定論，有待進一步研究。