馬明華，汪曉河，戴媛媛，顧小燕，吳鐵軍，年 華（. 上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，上海 00090；. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，上海 00437）

肺癌的發(fā)病率居于我國(guó)惡性腫瘤之首且正處于不斷上升的趨勢(shì)，其中70%～80%為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。由于肺癌的臨床癥狀不明顯，半數(shù)以上的患者就診時(shí)已屬于中、晚期，局限于各種環(huán)境、身體等因素，治療手段以化療為主，但5年存活率和生活質(zhì)量均達(dá)不到期望的效果[1]。大量實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)，中醫(yī)藥在治療和改善NSCLC患者的臨床癥狀、機(jī)體免疫功能、患者生存質(zhì)量及減少西藥和化療所產(chǎn)生的毒副作用等方面有一定程度的優(yōu)勢(shì)[2-4]。夏枯草消瘤合劑由中藥夏枯草、牡蠣、生地黃等中藥組成，是中醫(yī)腫瘤學(xué)專家錢(qián)伯文教授的經(jīng)驗(yàn)方。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方中所含的主要成分迷迭香酸可顯著抑制肺腺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且通過(guò)誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡來(lái)抑制其增殖，以及抑制肺癌A549細(xì)胞侵襲[5]。其臨床試驗(yàn)研究已證實(shí)，該藥配合一線化療方案治療中、晚期NSCLC患者，有助于提高患者的生存質(zhì)量和減少化療所產(chǎn)生的毒副作用[6]。本研究采用Lewis肺癌移植瘤模型[7]，從整體動(dòng)物模型的角度，對(duì)中藥復(fù)方進(jìn)一步研究。通過(guò)小鼠的大體觀察、HE染色、免疫組化等數(shù)據(jù)綜合分析，觀察夏枯草消瘤合劑肺癌移植瘤的療效，以期進(jìn)一步證實(shí)其抑制肺癌的作用機(jī)制，為臨床用藥提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物

夏枯草消瘤合劑(生藥濃度3.3 g/ml)委托上海寶龍藥業(yè)有限公司制備(生產(chǎn)批號(hào)：1711001)；順鉑[齊魯制藥(海南)有限公司，國(guó)字準(zhǔn)號(hào)：H20023461；批號(hào)：EA4A7046A；規(guī)格：每支20 mg，加生理鹽水溶解至0.2 mg/ml，現(xiàn)配現(xiàn)用]；兔抗鼠P16單克隆抗體（批號(hào)：ab51243）和兔抗鼠CyclinD1單克隆抗體（批號(hào)：ab134175），均購(gòu)自上海遜希生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料

SPF級(jí)4～6周雄性C57BL/6小鼠30只（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），以動(dòng)物普通飼料喂食，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬) 2017-005。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施符合《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物規(guī)范》。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將Lewis肺癌細(xì)胞在DMEM (含10%胎牛血清)完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為：37 ℃、5%CO2。細(xì)胞培養(yǎng)液2 d更換一次，胰蛋白酶(0.25%)消化傳代。

2.2 Lewis肺癌移植瘤模型的建立

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lewis肺癌瘤株用生理鹽水調(diào)成細(xì)胞懸液濃度為1×107個(gè)/ml，接種于C57BL/6小鼠右上肢腋窩皮下，每只0.2 ml，接種后常規(guī)喂食。

2.3 給藥方案

接種3 d后，按照隨機(jī)數(shù)字法將小鼠隨機(jī)分為3組：模型對(duì)照組(control組)、夏枯草消瘤合劑組(M組)、順鉑組(DDP組)，每組10只。造模7 d左右，以小鼠皮下腫瘤最長(zhǎng)直徑7 mm為造模成功。其中模型對(duì)照組飲用水灌胃0.2 ml，每日一次，連續(xù)14 d，同時(shí)給予0.2 ml生理鹽水腹腔注射，每2日一次；DDP組給予順鉑2 mg/kg，腹腔注射，每2日一次[8]，同時(shí)飲用水灌胃0.2 ml，每日一次，連續(xù)14 d；M組夏枯草消瘤合劑灌胃7.8 ml/kg，每日一次，連續(xù)14 d，同時(shí)給予0.2 ml生理鹽水腹腔注射，每2日一次。

2.4 標(biāo)本采集

末次給藥后24 h，麻醉后脫頸處死各鼠，摘取腫瘤組織并稱重，置于10%中性甲醛液中固定，48 h內(nèi)進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋。

2.5 HE染色

①取材、固定、脫水；②包埋、切片；③60 ℃恒溫箱中烘烤1 h；④二甲苯脫蠟3次，每次10 min；⑤水洗2次，每次5 min；⑥Harris蘇木素染色處理5 min；⑦水洗5 min；⑧1%鹽酸酒精溶液分化5 s，自來(lái)水洗返藍(lán)15 min；⑨0.5%伊紅（水溶性）染色1 min；80%乙醇2 min；95%乙醇2次，每次5 min；100%乙醇2次，每次5 min；⑩二甲苯透明處理2次，每次5 min，滴加1～2滴樹(shù)膠，加蓋玻片封固。

2.6 免疫組化

免疫組化染色使用Leica Bond Max全自動(dòng)免疫組化儀進(jìn)行染色：將福爾馬林固定、石蠟包埋的病理組織塊經(jīng)3 μm厚度連續(xù)切片；二甲苯脫蠟；梯度酒精水化；將玻片放入全自動(dòng)免疫組化儀中進(jìn)行染色，機(jī)器設(shè)置程序；加熱抗原修復(fù)15 min，冷卻至室溫（每步操作后均需用PBS漂洗）；3% H2O2溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；加一抗兔抗鼠p16單克隆抗體（1:150稀釋）、兔抗鼠CyclinD1單克隆抗 體（1:100稀 釋）20 min；Post Primary10 min；Polymer10 min；DAB顯色10 min；蘇木素復(fù)染；水洗后將玻片取出機(jī)器，梯度酒精脫水；二甲苯透明；中性樹(shù)膠封片。對(duì)照組設(shè)陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照，用已知陽(yáng)性表達(dá)組織作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核深黃色或棕黃色染色。

2.7 觀察指標(biāo)

2.7.1 大體觀察

分組給藥時(shí)測(cè)量小鼠體重和腫瘤大小，給藥開(kāi)始后每3 d稱一次體重。同時(shí)觀察并記錄給藥過(guò)程中及給藥后小鼠精神、外觀、活動(dòng)、體重的變化及腫瘤生長(zhǎng)情況。

2.7.2 Lewis肺癌移植瘤的重量和抑瘤率

連續(xù)給藥14 d后，于末次給藥24 h后測(cè)量體重，脫頸處死小鼠，手術(shù)剝?nèi)ジ鹘M小鼠的腫瘤組織，于電子天平上稱重，如果荷瘤模型對(duì)照組的平均瘤體重量不足1 g，則表示腫瘤組織生長(zhǎng)不良，數(shù)據(jù)不可用，需重新試驗(yàn)。

抑瘤率計(jì)算公式：抑瘤率(%)=(模型組平均瘤重—給藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

2.7.3 HE染色結(jié)果觀察

在200倍鏡下，觀察HE染色后各組腫瘤組織切片的病理情況。

2.7.4 免疫組化法檢查腫瘤組織中P16蛋白、CyclinD1蛋白表達(dá)情況

顯微鏡下400倍觀察切片，隨機(jī)選取3個(gè)界面，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。P16、CyclinD1蛋白檢測(cè)陽(yáng)性率＝陽(yáng)性反應(yīng)癌細(xì)胞數(shù)/癌細(xì)胞總數(shù)×100%。陽(yáng)性率＜10%為陰性（-），陽(yáng)性率10%～25%為弱陽(yáng)性（+），陽(yáng)性率25%～75%為中度陽(yáng)性（++），陽(yáng)性率＞75%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

2.7.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用（x±s）表示。多組間計(jì)量資料采用單因素方差分析LSD檢驗(yàn)，單向有序資料用Ridit檢驗(yàn)。以P＜0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 大體觀察

實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠的腫瘤呈現(xiàn)不同程度的生長(zhǎng)趨勢(shì)，其中，模型對(duì)照組小鼠腫瘤生長(zhǎng)最快，M組腫瘤生長(zhǎng)稍緩，DDP組小鼠腫瘤生長(zhǎng)最慢(圖1)。模型對(duì)照組小鼠體重呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，在第13天后，體重開(kāi)始下降；M組小鼠的體重先下降后呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；DDP組小鼠體重在首次給藥后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖2)。給藥14 d后，模型對(duì)照組小鼠活動(dòng)減少，攝食、飲水大幅減少，精神萎靡，無(wú)力，且毛色暗淡無(wú)光澤。M組小鼠行動(dòng)正常，反應(yīng)敏捷，攝食、飲水正常，毛色光澤濃密。DDP組小鼠給藥順鉑期間攝食、飲水極度減少，疲乏無(wú)力，精神萎靡，行動(dòng)極少，毛色無(wú)光澤且稀疏，給藥期間死亡1只。

3.2 Lewie肺癌移植瘤的重量和抑瘤率

M組和DDP組的瘤重均顯著低于模型對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)，抑 瘤 率 分 別 為24.85%、25.69%，與模型對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見(jiàn)表1、圖3。

表1 夏枯草消瘤合劑對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤抑制作用(n=10， xˉ±s)

3.3 HE染色

3組腫瘤組織HE染色結(jié)果顯示，模型對(duì)照組腫瘤組織細(xì)胞輪廓清晰，呈現(xiàn)片狀或巢狀分布，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，無(wú)壞死出現(xiàn)，且核大深染；而給藥組腫瘤組織細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的退變、壞死，M組可見(jiàn)基質(zhì)和間質(zhì)減少，腫瘤組織細(xì)胞核固縮、出現(xiàn)小片狀壞死； DDP組腫瘤組織內(nèi)有細(xì)胞核固縮，大片細(xì)胞崩解的碎片及壞死。同時(shí)，M組和DDP組間質(zhì)中血管成分均明顯減少，結(jié)果見(jiàn)圖4。

3.4 免疫組化

M組陽(yáng)性表達(dá)有8只，陽(yáng)性率為80%（8/10）；DDP組陽(yáng)性表達(dá)有8只，陽(yáng)性率為88.89%（8/9）。經(jīng)Ridit檢驗(yàn)，各給藥組陽(yáng)性表達(dá)情況和模型對(duì)照組相比差異不顯著，結(jié)果見(jiàn)表2、圖5。

模型對(duì)照組腫瘤組織的CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)有9只，陽(yáng)性率達(dá)到90%（9/10）；M組陽(yáng)性表達(dá)有6只，陽(yáng)性率為60%（6/10）；DDP組陽(yáng)性表達(dá)有3只，陽(yáng)性率為33.33%（3/9）。經(jīng)Ridit檢驗(yàn)，M組、DDP組的CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)情況和模型對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表3、圖6。

4 討論

表2 3組P16蛋白的表達(dá)情況(n=10)

表3 各組CyclinD1蛋白的表達(dá)情況(n=10)

在臨床上，早期的手術(shù)治療和晚期的化療始終是肺癌最主要的治療手段。但化療在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)也殺傷大量的正常細(xì)胞，損傷人體正氣，引起內(nèi)環(huán)境失衡，且其不良反應(yīng)明顯。傳統(tǒng)中醫(yī)理論十分重視氣血的疏通，所謂“氣血暢通，百病不侵”。氣助血行，氣滯則血瘀，血瘀則導(dǎo)致氣滯，形成正氣虧損和陰陽(yáng)失調(diào)。肺癌的病因主要有外感六邪、七情內(nèi)傷、飲食勞倦等，其發(fā)病根本在于正氣虛弱、臟腑功能失調(diào)。肺癌患者在正氣虛損的基礎(chǔ)上，外感六淫邪毒，趁虛入肺，導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)，肺氣雍滯，宣降失司，氣機(jī)不利，血行受阻，精液不布，聚而成痰，痰凝氣滯，痰阻脈絡(luò)，毒、痰、瘀膠結(jié)。治療上則以“扶正培本，解毒散結(jié)，化痰祛濕，活血化瘀”為主。夏枯草消瘤合劑是中醫(yī)腫瘤學(xué)專家錢(qián)伯文教授的經(jīng)驗(yàn)方，具有化痰軟堅(jiān)，活血化瘀，補(bǔ)養(yǎng)氣血的功效。該方由中藥夏枯草、牡蠣、生地黃、莪術(shù)、蒼術(shù)、白術(shù)等組成。方中夏枯草味苦、辛，性寒，破癥散結(jié)，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞增生并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；莪術(shù)味苦、辛，性溫，消淤消腫；白術(shù)味甘，性溫，理胃益脾；牡蠣味咸、平，性微寒，化痰軟堅(jiān)、清熱除濕；生地黃味甘，性寒，除寒熱積聚；蒼術(shù)味苦，性溫，善治冷氣癥瘕[9-10]。

腫瘤是一種細(xì)胞周期性疾病，細(xì)胞周期的調(diào)控失控是惡性腫瘤的本質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞呈無(wú)限制的自主增殖、分裂。在細(xì)胞周期調(diào)控中，GS期之間調(diào)控點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳遞，整合匯集到細(xì)胞核對(duì)細(xì)胞的增殖進(jìn)行調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)。該點(diǎn)調(diào)控的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，其長(zhǎng)短主要取決于G1期的時(shí)間長(zhǎng)短，故而在整個(gè)細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)中G1/S期該限制點(diǎn)尤為重要[11-12]。研究表明，腫瘤被認(rèn)為是一種細(xì)胞周期性疾病，多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞周期的失調(diào)均有著密切的關(guān)系[13]。細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）在細(xì)胞周期中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，其中，CyclinD已證實(shí)與卵巢癌、食管癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有一定的關(guān)系，是啟動(dòng)細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)中G1/S期轉(zhuǎn)換的重要調(diào)控因子[14-17]。目前研究最多的是CyclinD1，是重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，與其依賴性激酶CDK特異性結(jié)合能促進(jìn)細(xì)胞從G期到S期的轉(zhuǎn)換，從而使細(xì)胞增值失控而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，具有原始的致瘤特性。相關(guān)研究表明，CyclinD1在NSCLC中的陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)54.3%～76.0%，與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期均有關(guān)，提示CyclinD1作為一個(gè)原癌基因產(chǎn)物，在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[18-19]。P16蛋白是周期素依賴性激酶（CDK4）的抑制因子之一，直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控，可以通過(guò)抑制細(xì)胞周期來(lái)抑制細(xì)胞增殖與分裂。P16與CyclinD1競(jìng)爭(zhēng)與CDK4結(jié)合，從而阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞的增殖從而阻止細(xì)胞生長(zhǎng)。一旦P16的基因發(fā)生突變、缺失以及P16基因啟動(dòng)子甲基化等異常改變，關(guān)鍵酶CDK4的功能喪失，使P16蛋白不能得到正常表達(dá)。導(dǎo)致細(xì)胞不受控制的惡性增殖，加快了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[20-21]。綜上所述，夏枯草消瘤合劑抗NSCLC藥效及對(duì)腫瘤組織中CyclinD1、P16蛋白表達(dá)的影響，是值得研究的重要課題。

本研究結(jié)果表明：與DDP組相比，夏枯草消瘤合劑可有效改善小鼠的生活及精神狀態(tài)。根據(jù)3組腫瘤生長(zhǎng)及體重變化情況折線圖可以看出，M組在給藥期間小鼠體重比模型對(duì)照組小鼠的體重輕，但比DDP組小鼠的體重重，且腫瘤質(zhì)量顯著低于模型對(duì)照組(P＜0.05)；M組小鼠腫瘤體積比模型對(duì)照組小，但比DDP組大，顯示夏枯草消瘤合劑在有效抑制腫瘤生長(zhǎng)的情況下可以改善小鼠生活狀態(tài)。腫瘤組織形態(tài)顯示：模型對(duì)照組腫瘤組織細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，無(wú)壞死出現(xiàn)；夏枯草消瘤合劑組腫瘤組織細(xì)胞核固縮、有小片狀壞死情況； DDP組腫瘤組織內(nèi)有細(xì)胞核固縮，大片細(xì)胞崩解的碎片及壞死；免疫組化結(jié)果顯示，夏枯草消瘤合劑明顯降低CyclinD1蛋白表達(dá)，但提高P16蛋白表達(dá)的效果不顯著，說(shuō)明夏枯草消瘤合劑可能通過(guò)阻止腫瘤細(xì)胞進(jìn)入S期來(lái)抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)只是階段性總結(jié)，對(duì)于夏枯草消瘤合劑抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，P16蛋白和CyclinD1蛋白在NSCLC中的研究有著廣闊的前景，其不僅是在肺癌發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，對(duì)于預(yù)后也有一定的評(píng)估意義。隨著科學(xué)知識(shí)及分子生物學(xué)研究水平的不斷發(fā)展，相信P16、CyclinD1基因會(huì)成為NSCLC進(jìn)行基因治療的靶基因。