張 晶，顧永衛(wèi)，武 鑫，（. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥劑部，內(nèi)蒙古 呼和浩特 00050；. 上海維洱實驗室，上海07）

前列腺癌（PCa）已成為威脅男性健康的主要腫瘤之一[1]。大多數(shù)早期患者為雄激素依賴型（androgen-dependent prostate cancer, ADPC），在經(jīng)過抗雄激素治療1～1.5年后，ADPC轉(zhuǎn)為雄激素非依賴型前列腺癌（androgen-independent prostate cancer, AIPC）的概率較大，患者經(jīng)去勢治療后，病情會繼續(xù)惡化，甚至死亡[2-3]。因此，前列腺癌的治療方案需根據(jù)其ADPC和AIPC不同特性給予合理的治療，但在治療過程中難以對病程進階的過渡進行準確診斷，故而影響治療效果。研究一種可同時治療ADPC和AIPC的給藥系統(tǒng)是近年來研究的熱點[4]。本實驗在前期研究ADPC給藥基礎(chǔ)上[5]，選擇可同時靶向ADPC/AIPC型的2種前列腺癌細胞(LNCaP，PC3)表面CD71受體的第三代適配體C2min為靶頭[6]，并利用雙功能聚乙二醇（NHSPEG-MAL）將其與陽離子聚合物聚酰胺-胺（polyamidoamine，PAMAM）相連，裝載對2種癌細胞均具有抑制作用的基因藥物（siR-M），構(gòu)建雙重靶向的納米基因給藥系統(tǒng)（PAMAM-PEGC2min/siR-M），并對其理化性質(zhì)、體外攝取、轉(zhuǎn)染性質(zhì)以及體內(nèi)分布進行考察。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

Mercury Plus 300 MHz超導核磁共振波譜儀（Varian公司，美國）；IX2-RFACA倒置熒光顯微鏡（Olympus，日本）；FACSCalibur流式細胞儀（BD，美國）；C2min巰基化適體，（Ribo Bio，廣州）；pEGFP-N2-Luc綠色熒光蛋白和蟲熒光素酶表達質(zhì)粒pDNA（siR-m, Weijin Bio，中國）；化學發(fā)光檢測儀（Promega公司，美國）；QIAGEN Plasmid Mega Kit（Qiagen GmbH, 德國）；PAMAM (G5)溶液（5%，體積分數(shù)），Sulfhydryl Addition Kit，DyLight-633 NHS Ester，BCA Protein Assay kit（Thermo，美國）；雙功能聚乙二醇MAL-PEG-NHS，相對分子質(zhì)量4000（Nektar，美國）；FAM、cy-7、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶（Gibco, 美國）；其他試劑均為分析純。

1.2 細胞和實驗動物

ADPC細胞系LNCaP和AIPC細胞系PC3（中國科學院上海生命科學研究院）；BALB/C裸鼠，雄性（上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（蘇）2018-0006）。

1.3 細胞培養(yǎng)及荷2種移植瘤裸鼠模型的建立

LNCaP和PC3培養(yǎng)的培養(yǎng)基：含5%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640；培養(yǎng)條件：37 ℃、5%CO2[7]。每隔2～3 d更換培養(yǎng)液，并在細胞長至80%融合狀態(tài)時用于實驗。

將對數(shù)生長期的PC3和LNCaP細胞消化并稀釋成細胞懸液，濃度為：1×107個細胞/ml，將上述細胞懸液分別接種于裸鼠背部的兩側(cè)（0.2 ml/只）。接種15～20 d后，選擇腫瘤外觀圓潤、體積長至500 mm2左右的荷瘤裸鼠作為實驗模型。

1.4 PAMAM-PEG-C2min的合成與結(jié)構(gòu)鑒定

在定性實驗中，采用FAM-NSH示蹤PAMAM。FAM-PAMAM-PEG-C2min的制備：精密量取PAMAM (G5)甲醇溶液和FAM儲備液（摩爾比5:1），前者用氮氣吹干，4 ℃條件下，于暗處反應12 h，得到的產(chǎn)物通過G-25尺寸排阻色譜以除去游離的FAM，得FAM-PAMAM。再與PEG（NHS-PEGMAL）溶液混合（PEG和PAMAM的摩爾比為2 :1），在避光、室溫條件下反應15 min，利用超濾管（分子量截留為5000）對產(chǎn)物進行超濾純化，得FAMPAMAM-PEG。取C2min溶液和FAM-PAMAMPEG溶液（C2min和PAMAM摩爾比為1:1），室溫避光反應24 h，得FAM-PAMAM-PEG-C2min。cy7標記和非標記的PAMAM、PAMAM-PEG、PAMAM-PEG-C2min載體制備同前所述。并采用1H NMR對上述3種非FAM標記的載體進行結(jié)構(gòu)分析。

1.5 兩種前列腺癌細胞對PAMAM-PEG-C2min的攝取

將PC3和LNCaP細胞接種于6孔培養(yǎng)板中（6×104/孔），當細胞匯合度為80%時，更換為無血清培養(yǎng)液，并分別加入系列濃度為0.04、0.20、0.40、0.80和1.20 μmol/L的FAM-PAMAM-PEGC2min，與PC3和LNCaP共孵育1 h。PBS洗3次后，通過倒置熒光顯微鏡拍照觀察2種細胞對納米復合物的攝取情況。隨后將細胞消化并重懸于預冷的PBS中，通過流式細胞儀對2種前列腺癌細胞中FAM的陽性率進行定量檢測。

1.6 PAMAM-PEG-C2min/pDNA納米復合物的制備及表征

PAMAM、PAMAM-PEG和PAMAM-PEGC2min分別與質(zhì)粒溶液（12 μg/ml）按照PAMAM與DNA的N/P比1:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1漩渦混合30 s，即制得PAMAMpDNA、PAMAMPEGpDNA和PAMAM-PEG-C2minpDNA復合物。利用激光粒度分析儀Z90（Malvern，英國）測定不同N/P比PAMAM-PEGpDNA的粒徑和Zeta電位（n=3）。

1.7 PAMAM-PEG-C2min/pDNA體外轉(zhuǎn)染

PC3和LNCaP細胞接種于24孔培養(yǎng)板中（2×104/孔），細胞融合后更換無血清培養(yǎng)基，并加入“1.6”項下制備的不同N/P比的納米復合物（濃度：3 μg pDNA質(zhì)粒/孔），37 ℃、5% CO2條件孵育2 h后用完全培養(yǎng)基孵育48 h，采用倒置熒光顯微鏡（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm）拍照觀察報告基因綠色熒光蛋白的表達。隨后加入細胞裂解液對細胞裂解，并采用熒光素酶分析系統(tǒng)檢測細胞上清液中的基因表達產(chǎn)物熒光素酶的活性[8]。

1.8 納米復合物的體內(nèi)靶向性效果

取荷瘤裸鼠，尾靜脈注射cy7-PAMAM-PEGC2min（制備方法同“1.4”項），分別于給藥0.5、2、6、12、24 h時，利用動物活體成像儀觀察納米復合物在體內(nèi)的分布情況。

1.9 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18分析軟件進行獨立樣本t檢驗和描述性統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（x±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 PAMAM-PEG-C2min的結(jié)構(gòu)鑒定

雙功能NHS-PEG-MAL中NHS可與PAMAM表面帶有正電的氨基反應，生成PAMAM-PEG（PAMAM-PEG-MAL），PEG另一端的MAL可與C2min中的巰基反應，形成PAMAMA-PEG-C2min。1H NMR結(jié)果中D2O溶劑峰為4.7 ppm，PAMAM載體的特征峰在2.2～3.4 ppm（圖1A）；PEG帶有的亞甲基吸收峰出現(xiàn)在3.6 ppm，馬來酰亞胺的特征峰出現(xiàn)在8.3 ppm（圖1B），通過比較特征峰的峰面積，得出PEG的修飾率為2.4。C2min中各氨基氫的峰與PAMAM的特征峰重疊，表現(xiàn)為2.2～3.4 ppm的混合峰（圖1C），同時8.3 ppm處特征峰消失，表明C2min成功連接到PAMAM-PEG上，PAMAM-PEG-C2min合成成功。

2.2 兩種前列腺癌細胞對PAMAM-PEG-C2min的攝取

隨著PAMAM-PEG-C2min濃度升高，PC3和LNCaP中的熒光強度逐漸增強，說明LNCaP細胞和PC3細胞對納米復合物的攝取效率體現(xiàn)出濃度依賴性（圖2A）。定量檢測結(jié)果表明，PAMAM-PEGC2min濃 度 從0.04 μmol/L增 加 到0.12 μmol/L，LNCaP細胞陽性率從（10.31±0.38）%增加到（82.34±3.83）%，PC3細胞陽性率從（8.75±0.47）%增加到（85.37±3.25）%。且相同濃度下，LNCaP細胞和PC3細胞對納米復合物的攝取無明顯差異，與熒光顯微鏡定性結(jié)果一致(圖2B)。

2.3 不同N/P比PAMAM-PEG-C2min/pDNA納米復合物粒徑和Zeta電位

如圖3所示，PAMAM-PEG-C2min/pDNA基因遞送系統(tǒng)中N/P的增加，納米復合物粒徑逐漸降低，Zeta電位逐漸增加。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因是：陽離子PAMAM載體比例增大，納米復合物的電荷變大，其對基因的包載能力增強，包裹更加緊密。

2.4 PAMAM-PEG-C2min/pDNA體外轉(zhuǎn)染

PAMAM-PEG-C2min/pDNA體外轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，報告基因在細胞內(nèi)的表達效率與N/P成正比。熒光顯微鏡（圖4A）和生物發(fā)光檢測儀（圖4B）的檢測結(jié)果表明，隨著N/P比的增加，納米復合物的轉(zhuǎn)染能力增強。此外，PAMAM-PEG經(jīng)C2min修飾后，對2種細胞的轉(zhuǎn)染效率均顯著增強，表明PAMAM-PEG-C2min納米復合物可有效地靶向2種不同類型的前列腺癌細胞。

2.5 納米復合物的體內(nèi)靶向性效果

荷瘤裸鼠體內(nèi)熒光分布如圖5所示，Cy7-PAMAM-PEG-C2min經(jīng)尾靜脈注射0.5 h后，通過血液循環(huán)分布于全身；2 h后，在腫瘤部位聚集，體現(xiàn)出腫瘤靶向性；12 h后熒光強度降低；24 h后，熒光基本消失。結(jié)果顯示，C2min修飾的納米載體給藥后，腫瘤部位的熒光強度均高于其他部位，對實體瘤具有顯著的特異靶向性，實現(xiàn)可同時靶向ADPC和AIPC組織的作用。

3 討論

PAMAM是一種陽離子型聚合物，被廣泛應用于基因載體的研究，具有粒徑易控、表面可修飾等特點[9]。寡核苷酸適配體簡稱適體，是一種能與多種靶分子特異性結(jié)合的單鏈或雙鏈寡核苷酸，具有廣泛的受體范圍[10-12]。且適體制備方便，有較高的穩(wěn)定性，在生產(chǎn)、儲存和運輸中有很大的優(yōu)勢[6,13]。LNCaP和PC3表面均高表達CD71受體，且第三代新型適體C2min，可以與CD71很好的結(jié)合[14]。C2min具有43個核苷酸長度(43 nt)，體內(nèi)外穩(wěn)定性良好。因此，以C2min適體作為靶頭，可實現(xiàn)對2種前列腺癌細胞的雙重靶向。

核磁共振譜圖結(jié)果表明，本研究成功合成了PAMAM-PEG-C2min，體外攝取實驗證明，經(jīng)C2min修飾的納米復合物可顯著增加PC3和LNCaP的攝取能力。隨著PAMAM-PEG-C2min-pDNA中N/P比的增加，電荷逐漸增大，粒徑逐漸減小，表明納米復合物對質(zhì)粒的包載更加緊密，且納米復合物的粒徑和電位是影響其攝取和轉(zhuǎn)染效率的主要因素[15]，體外轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果表明，隨著N/P比的增加，納米復合物在2種前列腺癌細胞中轉(zhuǎn)染效率有顯著性提高。且經(jīng)C2min修飾后，表現(xiàn)出良好的體外靶向能力。動物活體成像結(jié)果表明，PAMAMPEG-C2min可同時靶向2種前列腺癌組織，是一種良好的藥物靶向遞送載體，為前列腺癌不同發(fā)展階段的綜合治療和靶向治療提供了新的技術(shù)平臺。